本文關(guān)鍵詞：基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的水痘—帶狀皰疹病毒中和抗體檢測(cè)方法的建立

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【摘要】：水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella Zoster Virus, VZV)是引起水痘和帶狀皰疹的病原體,具有嚴(yán)重的危害性。目前已有基于vOka株的水痘減毒活疫苗上市,在較好地預(yù)防水痘的同時(shí),卻增加了接種者帶狀皰疹的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。由VZV引發(fā)的帶狀皰疹目前尚缺乏特效治療藥物。VZV中和抗體在阻斷病毒體內(nèi)擴(kuò)散及感染中起到重要的作用,同時(shí)也有望成為帶狀皰疹的特異治療藥物。然而,目前對(duì)于VZV中和抗體的檢測(cè)方法仍存在許多問(wèn)題,難于同時(shí)滿足快速、準(zhǔn)確、高通量的需求。為此,本研究探索建立一種新型的基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法的VZV中和抗體高通量檢測(cè)方法。 本研究首先探索獲得可高效檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)病毒抗原的檢測(cè)抗體。由于膜蛋白是暴露在VZV顆粒表面的包膜組成成分,存在親和表位和中和表位,因此本研究將探索獲得具有良好反應(yīng)特異性和檢測(cè)靈敏度的VZV糖蛋白單抗。通過(guò)對(duì)VZV保護(hù)液成分優(yōu)化和凍融時(shí)間的摸索制備獲得高滴度的無(wú)細(xì)胞VZV病毒。將無(wú)細(xì)胞病毒免疫小鼠后篩選獲得6株可特異性結(jié)合Glycoprotein K(gK)抗原的單克隆抗體。對(duì)這6株單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步的表位鑒定,確定其關(guān)鍵親和表位處于gK的281-295位氨基酸。選擇其中一株單抗18A10進(jìn)行進(jìn)一步鑒定,確定了其最短結(jié)合表位和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的分布。本研究進(jìn)一步制備了辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的18A10(HRP-18A10)用于VZV感染細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè),對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)間、感染滴度等優(yōu)化,成功建立了較為穩(wěn)定的VZV中和抗體酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的空斑減少法平行比較,新型酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法對(duì)鼠血清標(biāo)本的檢測(cè)特異性為100%,檢測(cè)結(jié)果一致性為95.65%,顯示了新方法具有良好的可靠性。VZV中和抗體酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法的檢測(cè)時(shí)間僅需2天,可在96孔板中利用自動(dòng)化的儀器設(shè)備進(jìn)行快速檢測(cè),避免了傳統(tǒng)方法的主觀誤差,有利于進(jìn)行快速高通量檢測(cè)。 綜上所述,本研究通過(guò)篩選獲得了VZV-gK的特異性單克隆抗體,并應(yīng)用于建立VZV中和抗體酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)法,相比于空斑減少法,存在省時(shí)、高通量檢測(cè)的明顯優(yōu)勢(shì),并且能夠保證血清樣本的檢測(cè)正確率,可為臨床血清的檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室中和表位研究提供更多支持。
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373.11

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1 陳麗宏;基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的水痘—帶狀皰疹病毒中和抗體檢測(cè)方法的建立[D];廈門大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1176705