本文關鍵詞：人源化抗CD20單克隆抗體理化性質和初步結晶研究

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【摘要】：研究目的： 利妥昔單克隆抗體藥（通用名，國際非專利藥品名稱：Rituximab）是由羅氏Roche制藥廠所生產的一種作用于人類CD20的人鼠嵌合單克隆抗體，是全球首個被批準臨床的用于治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）的單克隆抗體藥物。由于CD20主要表現于B淋巴球細胞表面，因此該制品可用來治療因B淋巴球過多所造成的疾病，包括淋巴癌、白血病、移殖排斥和某些自體免疫疾病；目前，該制品已經通過中國食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準并進入中國市場（商品名：美羅華），在其臨床實踐中，該單抗顯示出較好的療效和安全性；但在實際應用過程中也發(fā)現了一些的問題，如部分患者對利妥昔單抗的治療并不產生臨床反應；部分患者單獨使用該藥時，臨床治愈率非常低；部分經臨床治療有效的患者，，停藥后會很快出現病情復發(fā)或進展，或者再次使用時產生治療抵抗現象[1]。針對這些現象，開發(fā)人源化的抗CD20單克隆抗體藥物就顯得尤為重要。 本文通過將獲得的人源化抗CD20單克隆抗體對照品原液和抗體樣品原液進行再純化，配制成適宜的濃度，鑒定和比較二者的紫外吸收光譜、肽圖、輕重鏈分子量、等電點、電荷異質體含量等結構信息；檢測并比較二者的蛋白質純度、Protein A殘留（ELISA）和CHO細胞蛋白殘留（ELISA）等質量信息。在此基礎上，對兩種抗體樣品進行初步結晶條件探索。 研究方法： 將抗體對照品和抗體樣品再純化、配制、分裝和標定后，用SEC-HPLC法和非還原型SDS-PAGE法檢測抗體樣品和對照品的純度；還原SDS-PAGE法檢測抗體對照品和樣品的純度和輕重鏈分子量；CEX-HPLC法分析抗體樣品和對照品的電荷異質體含量；cIEF法測定抗體樣品和對照品的等電點；比較抗體樣品和對照品的紫外吸收光譜；RP-HPLC分析抗體樣品和對照品的肽譜圖；ELISA法檢測抗體樣品和對照品的CHO細胞蛋白殘留量；ELISA法檢測抗體樣品和對照品的Protein A殘留量；在這些質量和結構信息的基礎上，對抗體樣品和對照品的初步結晶條件進行探索及X-Ray分析。 研究結果： 抗體樣品和抗體對照品經SP Sepharose FF陽離子層析后，蛋白質含量分別為16.1mg/ml和16.3mg/ml；配制后每種抗體蛋白均稀釋為1.0mg/ml和10mg/ml兩種規(guī)格；SEC-HPLC法檢測抗體樣品和對照品的純度分別為99.2%和99.3%；還原SDS-PAGE法檢測抗體樣品和對照品的純度和輕重鏈分子量結果顯示，二者具有一致性，輕重鏈分子量分別為58kD和27kD，與理論值相吻合；CEX-HPLC法分析抗體樣品和對照品的電荷異質體含量顯示，二者均呈現良好的電荷均一性，達到蛋白質結晶的要求；非還原SDS-PAGE法檢測抗體樣品和對照品的純度結果顯示，二者純度均達到100%，分子量約為135kD，二者呈現一致性；通過精確的cIEF法測定抗體樣品和對照品的等電點，結果顯示二者的等電點分別為9.23和9.20，考慮到系統(tǒng)誤差，二者呈現一致性，與理論值相符；通過對抗體樣品和對照品進行紫外吸收光譜分析，結果表明，二者最大紫外吸收波長均為277nm，在理論值范圍內；通過RP-HPLC分析抗體樣品和對照品的肽譜圖，結果顯示，二者的肽圖具有一致性；ELISA法檢測抗體樣品和對照品的CHO細胞蛋白殘留量，結果表明，二者均未檢出殘留宿主蛋白，適合進行蛋白質結晶；ELISA法檢測抗體樣品和對照品的Protein A殘留量，結果顯示，二者均未檢出殘留蛋白A，適合進行蛋白質結晶；抗體樣品和對照品的初步結晶條件探索，結果顯示，發(fā)現一種初步結晶條件，晶體均為孿晶，經X-Ray分析表明，晶體為蛋白質，分辨率約為8左右，無法收集晶體的X-Ray衍射信息。 研究結論： 鑒定并比較人源化抗CD20單克隆抗體對照品和樣品的質量和結構，結構鑒定和分析結果顯示，二者具有一致性并與理論值相吻合；質量檢測結果表明二者達到蛋白質結晶的質量要求；在此基礎上對二者進行了初步結晶條件探索，成功獲得了孿晶，為今后的結晶條件優(yōu)化和從結構上研究該抗體的功能和作用機制奠定了基礎，也為該人源化單克隆抗體在藥學和臨床醫(yī)學應用開辟了新的研究思路。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前4條

1 李倩;馬曉梅;湯德元;;沉淀法分離鎂的理論與實踐[J];貴州化工;2010年02期

2 熊拯;;大豆分離蛋白溶解性的影響因素研究[J];農產品加工(學刊);2012年03期

3 姬燕培;崔虹;;蛋白質結晶研究進展[J];河北化工;2012年09期

4 甄永蘇;苗慶芳;;抗體藥物與腫瘤靶向治療[J];中國醫(yī)藥生物技術;2006年01期

中國博士學位論文全文數據庫 前1條

1 張曉麗;FAD依賴的胸苷合成酶ThyX的晶體結構與功能研究和CagF蛋白的初步晶體學研究[D];第三軍醫(yī)大學;2010年

本文編號：1175832