本文關(guān)鍵詞：人源化抗CD20單克隆抗體理化性質(zhì)和初步結(jié)晶研究

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【摘要】：研究目的： 利妥昔單克隆抗體藥（通用名，國(guó)際非專利藥品名稱：Rituximab）是由羅氏Roche制藥廠所生產(chǎn)的一種作用于人類CD20的人鼠嵌合單克隆抗體，是全球首個(gè)被批準(zhǔn)臨床的用于治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）的單克隆抗體藥物。由于CD20主要表現(xiàn)于B淋巴球細(xì)胞表面，因此該制品可用來(lái)治療因B淋巴球過(guò)多所造成的疾病，包括淋巴癌、白血病、移殖排斥和某些自體免疫疾��；目前，該制品已經(jīng)通過(guò)中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)并進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)（商品名：美羅華），在其臨床實(shí)踐中，該單抗顯示出較好的療效和安全性；但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了一些的問(wèn)題，如部分患者對(duì)利妥昔單抗的治療并不產(chǎn)生臨床反應(yīng)；部分患者單獨(dú)使用該藥時(shí)，臨床治愈率非常低；部分經(jīng)臨床治療有效的患者，，停藥后會(huì)很快出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)或進(jìn)展，或者再次使用時(shí)產(chǎn)生治療抵抗現(xiàn)象[1]。針對(duì)這些現(xiàn)象，開(kāi)發(fā)人源化的抗CD20單克隆抗體藥物就顯得尤為重要。 本文通過(guò)將獲得的人源化抗CD20單克隆抗體對(duì)照品原液和抗體樣品原液進(jìn)行再純化，配制成適宜的濃度，鑒定和比較二者的紫外吸收光譜、肽圖、輕重鏈分子量、等電點(diǎn)、電荷異質(zhì)體含量等結(jié)構(gòu)信息；檢測(cè)并比較二者的蛋白質(zhì)純度、Protein A殘留（ELISA）和CHO細(xì)胞蛋白殘留（ELISA）等質(zhì)量信息。在此基礎(chǔ)上，對(duì)兩種抗體樣品進(jìn)行初步結(jié)晶條件探索。 研究方法： 將抗體對(duì)照品和抗體樣品再純化、配制、分裝和標(biāo)定后，用SEC-HPLC法和非還原型SDS-PAGE法檢測(cè)抗體樣品和對(duì)照品的純度；還原SDS-PAGE法檢測(cè)抗體對(duì)照品和樣品的純度和輕重鏈分子量；CEX-HPLC法分析抗體樣品和對(duì)照品的電荷異質(zhì)體含量；cIEF法測(cè)定抗體樣品和對(duì)照品的等電點(diǎn)；比較抗體樣品和對(duì)照品的紫外吸收光譜；RP-HPLC分析抗體樣品和對(duì)照品的肽譜圖；ELISA法檢測(cè)抗體樣品和對(duì)照品的CHO細(xì)胞蛋白殘留量；ELISA法檢測(cè)抗體樣品和對(duì)照品的Protein A殘留量；在這些質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息的基礎(chǔ)上，對(duì)抗體樣品和對(duì)照品的初步結(jié)晶條件進(jìn)行探索及X-Ray分析。 研究結(jié)果： 抗體樣品和抗體對(duì)照品經(jīng)SP Sepharose FF陽(yáng)離子層析后，蛋白質(zhì)含量分別為16.1mg/ml和16.3mg/ml；配制后每種抗體蛋白均稀釋為1.0mg/ml和10mg/ml兩種規(guī)格；SEC-HPLC法檢測(cè)抗體樣品和對(duì)照品的純度分別為99.2%和99.3%；還原SDS-PAGE法檢測(cè)抗體樣品和對(duì)照品的純度和輕重鏈分子量結(jié)果顯示，二者具有一致性，輕重鏈分子量分別為58kD和27kD，與理論值相吻合；CEX-HPLC法分析抗體樣品和對(duì)照品的電荷異質(zhì)體含量顯示，二者均呈現(xiàn)良好的電荷均一性，達(dá)到蛋白質(zhì)結(jié)晶的要求；非還原SDS-PAGE法檢測(cè)抗體樣品和對(duì)照品的純度結(jié)果顯示，二者純度均達(dá)到100%，分子量約為135kD，二者呈現(xiàn)一致性；通過(guò)精確的cIEF法測(cè)定抗體樣品和對(duì)照品的等電點(diǎn)，結(jié)果顯示二者的等電點(diǎn)分別為9.23和9.20，考慮到系統(tǒng)誤差，二者呈現(xiàn)一致性，與理論值相符；通過(guò)對(duì)抗體樣品和對(duì)照品進(jìn)行紫外吸收光譜分析，結(jié)果表明，二者最大紫外吸收波長(zhǎng)均為277nm，在理論值范圍內(nèi)；通過(guò)RP-HPLC分析抗體樣品和對(duì)照品的肽譜圖，結(jié)果顯示，二者的肽圖具有一致性；ELISA法檢測(cè)抗體樣品和對(duì)照品的CHO細(xì)胞蛋白殘留量，結(jié)果表明，二者均未檢出殘留宿主蛋白，適合進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶；ELISA法檢測(cè)抗體樣品和對(duì)照品的Protein A殘留量，結(jié)果顯示，二者均未檢出殘留蛋白A，適合進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶；抗體樣品和對(duì)照品的初步結(jié)晶條件探索，結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)一種初步結(jié)晶條件，晶體均為孿晶，經(jīng)X-Ray分析表明，晶體為蛋白質(zhì)，分辨率約為8左右，無(wú)法收集晶體的X-Ray衍射信息。 研究結(jié)論： 鑒定并比較人源化抗CD20單克隆抗體對(duì)照品和樣品的質(zhì)量和結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)鑒定和分析結(jié)果顯示，二者具有一致性并與理論值相吻合；質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明二者達(dá)到蛋白質(zhì)結(jié)晶的質(zhì)量要求；在此基礎(chǔ)上對(duì)二者進(jìn)行了初步結(jié)晶條件探索，成功獲得了孿晶，為今后的結(jié)晶條件優(yōu)化和從結(jié)構(gòu)上研究該抗體的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為該人源化單克隆抗體在藥學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用開(kāi)辟了新的研究思路。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：1175832