發(fā)布時(shí)間：2017-11-12 12:09

  本文關(guān)鍵詞：酒精代謝關(guān)鍵酶的基因分型方法研究

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【摘要】：目的： 酒精（乙醇）在體內(nèi)的代謝主要有賴于乙醇脫氫酶（2ADH2）、乙醛脫氫酶（2ALDH2）兩種酶的催化，前者可將乙醇轉(zhuǎn)化成乙醛，后者可將有毒、致癌的乙醛轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的乙酸。兩種酶的編碼基因各有一個(gè)嚴(yán)重影響酶活性的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)即ADH2基因G143A位點(diǎn)（rs1229984位點(diǎn)）、ALDH2基因G1510A位點(diǎn)（rs671位點(diǎn)），與個(gè)體的酒精代謝能力及酒精相關(guān)性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。 本研究擬建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的rs1229984及rs671位點(diǎn)的基因分型方法，以促進(jìn)酒精代謝關(guān)鍵酶的基因分型工作在基層衛(wèi)生部門的開展，便于民眾從基因水平了解自己的酒精耐受性，從而合理、健康飲酒，降低酒精相關(guān)性疾病的發(fā)生。本研究還將對(duì)廣東人群rs1229984及rs671位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率進(jìn)行調(diào)查，以期為酒精相關(guān)性疾病的預(yù)防干預(yù)提供參考依據(jù)。 方法： 1.針對(duì)rs671位點(diǎn)的分型：以100例樣品為研究對(duì)象，嘗試如下五種方案，它們均以聚合酶鏈反應(yīng) 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR RFLP）為基礎(chǔ)，但在PCR模板的制備方法、PCR引物的設(shè)計(jì)修飾、快速限制性核酸內(nèi)切酶的選用、酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)等方面存在一定差異： (1)方案一：以提純的口腔拭子基因組DNA為模板，用與模板完全配對(duì)的一對(duì)引物F1、R1擴(kuò)增跨越rs671位點(diǎn)的片段，PCR產(chǎn)物理論長(zhǎng)度為535bp，野生型等位基因ALDH2*1（G1510）的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點(diǎn)含有限制性核酸內(nèi)切酶TspRⅠ識(shí)別位點(diǎn)（NNCASTGNN↓)，突變型等位基因ALDH2*2（A1510）的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點(diǎn)不含TspRⅠ識(shí)別位點(diǎn)，此外，兩者均在多態(tài)位點(diǎn)下游含有1個(gè)TspRⅠ識(shí)別位點(diǎn)。用快速限制性核酸內(nèi)切酶TspRⅠ于65℃酶切消化PCR產(chǎn)物5min，用4.0%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，根椐限制性酶切圖譜確定每份樣品的基因型。3種基因型的判斷依據(jù)為：野生型純合子ALDH2*1/ALDH2*1（GG）的條帶為255、150.5、129.5bp；突變型純合子ALDH2*2/ALDH2*2（AA）的條帶為405.5、129.5bp；雜合子ALDH2*1/ALDH2*2（GA）的條帶為405.5、255、150.5、129.5bp。 (2)方案二：除PCR模板為口腔拭子粗處理液外，余者與方案一相同。 (3)方案三：以口腔拭子粗處理液為模板，通過(guò)半巢氏PCR擴(kuò)增跨越rs671位點(diǎn)的靶片段。第一輪PCR所用引物與方案1完全一致，即F1、R1，第2輪PCR的下游引物R1保持不變，上游內(nèi)引物F2與模板完全配對(duì)，擴(kuò)增產(chǎn)物為467bp，野生型等位基因ALDH2*1（G1510）的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點(diǎn)含有限制性核酸內(nèi)切TspRⅠ(NNCASTGNN↓)識(shí)別位點(diǎn)，突變型等位基因ALDH2*2（A1510）的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點(diǎn)不含TspRⅠ識(shí)別位點(diǎn)，此外，兩者均在多態(tài)位點(diǎn)下游含有1個(gè)TspRⅠ識(shí)別位點(diǎn)。用快速限制性核酸內(nèi)切酶TspRⅠ于65℃酶切消化PCR產(chǎn)物5min，用4.0%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段制作限制性酶切圖譜。3種基因型的判斷依據(jù)為：野生型純合子GG的條帶為255、129.5、82.5bp；突變型純合子AA的條帶為337.5、129.5bp；雜合子GA的條帶為337.5、255、129.5、82.5bp。 (4)方案四：以口腔拭子粗處理液為模板，用巢氏PCR擴(kuò)增靶片段，其中第1輪PCR引物為與模板完全配對(duì)的引物F4、R1，第2輪引物采用F3、R3,其中F3與模板完全配對(duì)，R3為長(zhǎng)達(dá)56nt的引物【該引物靠近3′端倒數(shù)第3、第4個(gè)堿基與模板錯(cuò)配，以在野生型等位基因的多態(tài)位點(diǎn)附近引入HinfⅠ（GA↓NTC）識(shí)別位點(diǎn)，此外還在引物5’端增加了1個(gè)33nt的接頭以增加后續(xù)酶切分型的分辨率】。擴(kuò)增產(chǎn)物理論長(zhǎng)度為372bp，野生型等位基因ALDH2*1的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點(diǎn)含有限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ識(shí)別位點(diǎn)，突變型等位基因ALDH2*2的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點(diǎn)不含HinfⅠ識(shí)別位點(diǎn)，此外，兩者均在多態(tài)位點(diǎn)上游含有1個(gè)HinfⅠ識(shí)別位點(diǎn)。用快速限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ于37℃酶切消化PCR產(chǎn)物5min，用4.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段判定基因型，3種基因型的判斷依據(jù)為：野生型純合子GG的條帶為236、81.5、54.5bp；突變型純合子AA的條帶為290.5、81.5bp；雜合子GA的條帶為290.5、236、81.5、54.5bp。 (5)方案五：以提純的口腔拭子基因組DNA為模板，PCR引物為方案四中所用第2輪引物F3、R3，擴(kuò)增的靶片段理論長(zhǎng)度也為372bp，用快速限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ于37℃酶切消化PCR產(chǎn)物5min，用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶切片段，經(jīng)銀染顯示限制性酶切圖譜，基因型的判斷依據(jù)方案四。 2.以篩查出的ALDH2*1/*1、ALDH2*2/*2基因型樣品為模板，通過(guò)T A克隆構(gòu)建含ALDH2*1、ALDH2*2等位基因的重組質(zhì)粒，并測(cè)序加以驗(yàn)證。3.針對(duì)rs1229984的分型：以100例樣品的粗處理液為模板，用半巢氏PCR擴(kuò)增靶片段，其中第1輪PCR引物為F5、R6，它們與模板完全配對(duì)，第2輪PCR引物采用F6、R6，F(xiàn)6為長(zhǎng)達(dá)59nt的引物【該引物靠近3′端倒數(shù)第2個(gè)堿基與模板錯(cuò)配，以在野生型等位基因的多態(tài)位點(diǎn)附近引入限制性核酸內(nèi)切酶HhaⅠ（GC↓GC）識(shí)別位點(diǎn)，此外還在引物5’端增加了1個(gè)39nt的接頭以增加后續(xù)酶切分型的分辨率】。擴(kuò)增產(chǎn)物理論長(zhǎng)度為393bp，野生型等位基因ADH2*1（G143）的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點(diǎn)含有HhaⅠ識(shí)別位點(diǎn)，突變型等位基因ADH2*2（A143）的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點(diǎn)不含HhaⅠ識(shí)別位點(diǎn)，此外，兩者均在多態(tài)位點(diǎn)下游含有1個(gè)HhaⅠ識(shí)別位點(diǎn)。用快速限制性核酸內(nèi)切酶HhaⅠ于37℃酶切消化PCR產(chǎn)物5min，用4.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段判定基因型，突變型型純合子AA的條帶為286、107bp；野生型純合子GG的條帶為227、107、59bp；雜合子GA的條帶為286、227、107、59bp。 4.采用上述建立的巢式PCR RFLP和半巢式PCR RFLP法，分別對(duì)346例廣東人的樣品進(jìn)行rs671、rs1229984位點(diǎn)的分型，統(tǒng)計(jì)相應(yīng)的基因頻率和基因型頻率，通過(guò)Hardy Weinberg遺傳平衡檢測(cè)分析樣本是否具有群體代表性，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS v19.0分析廣東人群rs671、rs1229984位點(diǎn)的分布頻率是否與其它地區(qū)人群存在差異。 結(jié)果： 1.五種基于PCR RFLP的ALDH2基因G1510A位點(diǎn)（rs671位點(diǎn)）分型方法，每種方法都能在PCR階段獲得預(yù)期大小的靶片段，PCR產(chǎn)物的酶切消化均在10分鐘內(nèi)完成，制作的限制性酶切圖譜都非常清晰且符合理論預(yù)期；對(duì)同一批樣品（100例）進(jìn)行的分型實(shí)驗(yàn)，顯示五種方法的分型結(jié)果完全一致；每種方法均隨機(jī)抽取3種基因型樣品進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果完全正確。 2.PCR及測(cè)序證實(shí)ALDH2*1（野生型等位基因）、ALDH2*2（突變型等位基因）已成功克隆到pMD18 T載體上。 3.建立了一種ADH2基因G143A位點(diǎn)（rs1229984位點(diǎn)）快速分型方法，，對(duì)100例樣品進(jìn)行分型，PCR結(jié)果清晰，酶切結(jié)果符合預(yù)期，隨機(jī)抽取的3種基因型樣品測(cè)序結(jié)果同所建立方法的分型結(jié)果完全一致。 4.對(duì)來(lái)自廣東人群的346例樣品（男181例、女165例）進(jìn)行ALDH2基因G1510A位點(diǎn)的分型，結(jié)果顯示，ALDH2*1/*1、ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2三種基因型的頻率分別為0.51、0.44、0.05；等位基因G（ALDH2*1）的頻率為0.727，等位基因A（ALDH2*2）的頻率為0.273。經(jīng)Hardy Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn),2=3.40, P=0.182，說(shuō)明樣本具有群體代表性。 對(duì)上述346例樣品進(jìn)行ADH2基因G143A位點(diǎn)的分型，結(jié)果顯示，ADH2*1/*1、ADH2*1/*2、ADH2*2/*2三種基因型的頻率分別為0.10、0.47、0.43；等位基因G （ADH2*1）的頻率為0.34，等位基因A （ADH2*2）的頻率為0.66。經(jīng)Hardy Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn),2=0.88,P=0.644（P0.05)，說(shuō)明樣本具有群體代表性。 5. rs1229984、rs671兩個(gè)位點(diǎn)在廣東人群的9種基因型組合ADH2(GG)/ALDH2(GG)、ADH2(GG)/ALDH2(GA)、 ADH2(GG)/ALDH2(AA)、 ADH2(GA)/ALDH2(GG)、ADH2(GA)/ALDH2(GA)、 ADH2(GA)/ALDH2(AA)、 ADH2(AA)/ALDH2(GG)、ADH2(AA)/ALDH2(GA)、ADH2(AA)/ALDH2(AA)，頻率分別為：0.052、0.043、0.006、0.272、0.176、0.02、0.185、0.217、0.029 6.針對(duì)rs671位點(diǎn)，廣東人群與云南人群的基因型頻率的卡方檢驗(yàn)結(jié)果，2值為8.893,P大于0.005，表示無(wú)顯著性差異；等位基因分布2值為7.943，P小于0.005，表明有顯著性差異；與洛陽(yáng)、湖南、四川人群的基因型分布頻率的卡方檢驗(yàn)結(jié)果，其基因型頻數(shù)卡方值分別為15.043、61.618、16.619，P值均小于0.005；其等位基因分布頻數(shù)卡方值分別為13.760、25.531、15.293，且P值均小于0.005，表明有顯著性差異。 針對(duì)ADH2基因rs1229984位點(diǎn)，廣東人群與泰興人群的基因型頻率卡方檢驗(yàn)結(jié)果2值分別為0.891，P值為0.640(p0.005)，表示無(wú)顯著性差異；與云南、洛陽(yáng)、鄂倫春族人群的基因型分布頻率卡方檢驗(yàn)結(jié)果，其基因型頻數(shù)卡方值分別為13.174、11.503、54.444，P值均小于0.005,表明有顯著性差異。廣東人群與洛陽(yáng)、泰興人群等位基因型頻率卡方檢驗(yàn)結(jié)果2值分別為6.111，0.697，P值分別為0.013，0.404(p0.005)，表示無(wú)顯著性差異；與云南、鄂倫春族人群的基因型分布頻率卡方檢驗(yàn)結(jié)果，其基因型頻數(shù)卡方值分別為12.147、52.501，P值均小于0.005,表明有顯著性差異。 結(jié)論： 1.針對(duì)ALDH2基因G1510A位點(diǎn)（rs671位點(diǎn)），成功建立了5種基于PCR RFLP的分型方法。PCR RFLP法為經(jīng)典的基因分型方法，本身具有簡(jiǎn)便性。本研究中，每種方法都在PCR產(chǎn)物的多態(tài)位點(diǎn)外含有1個(gè)對(duì)照酶切位點(diǎn)，可避免各種因素造成的酶切不完全所導(dǎo)致的結(jié)果誤判，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性；每種方法都采用了可在5 10分鐘內(nèi)完成酶切的快速內(nèi)切酶，從而大大降低了分型的時(shí)間。整個(gè)分型的時(shí)間從3h～5h30min不等，分型的成本介于2.5 15.0元之間，方法具有快速、經(jīng)濟(jì)性。 2.成功構(gòu)建了pMD18 T ALDH2*1、pMD18 T ALDH2*2重組質(zhì)粒，可作為rs671位點(diǎn)分型的對(duì)照品，為開發(fā)rs671位點(diǎn)分型試劑盒奠定了基礎(chǔ)。 3.成功建立了半巢式PCR RFLP法檢測(cè)ADH2基因G143A位點(diǎn)（rs1229984位點(diǎn)）的方法，PCR產(chǎn)物中同樣含有對(duì)照酶切位點(diǎn)以保證分型的準(zhǔn)確性，整個(gè)分型工作可在3h左右完成，成本3元左右。 4.廣東人群男性、女性之間rs671位點(diǎn)的基因頻率分布無(wú)顯著性差異（卡方值為2.700，P值為0.259）；rs1229984位點(diǎn)的基因頻率分布也無(wú)顯著性差異（卡方值為1.814，P值為0.404）。 5.廣東人群攜帶酒精性相關(guān)疾病高風(fēng)險(xiǎn)ALDH2*2等位基因者（即ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2基因型總和）高達(dá)49.0%。 6.對(duì)rs671位點(diǎn)的基因型頻率分布分析，廣東人群與云南人群無(wú)顯著性差異，廣東人群與洛陽(yáng)、湖南、四川人群有顯著性差異。等位基因頻率分布分析，廣東人群與云南洛陽(yáng)、湖南、四川人群有顯著性差異。 對(duì)rs1229984位點(diǎn)的基因型頻率分布分析，廣東人群與泰興人群無(wú)顯著性差異，與云南、洛陽(yáng)、鄂倫春族人群有顯著性差異；等位基因頻率分布分析，廣東人群與洛陽(yáng)、泰興人群無(wú)顯著性差異，與云南、鄂倫春族人群有顯著性差異。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411

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本文編號(hào)：1175830