本文關(guān)鍵詞：淋病奈瑟菌PorB重組蛋白的誘導表達和純化及其抗原性的初步研究

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【摘要】：研究目的 誘導pGEX4T-PorB原核表達載體,使其在宿主菌E. coliBL21(DE3)中實現(xiàn)高水平表達,并純化PorB蛋白,通過Western印跡初步鑒定PorB蛋白的抗原性,為進一步研究其抗原性、免疫保護性及免疫動物模型提供科學依據(jù)。 研究方法 1. pGEX4T-PorB原核表達載體的誘導和檢測：用異丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導本實驗室己構(gòu)建的pGEX-4T-PorB重組質(zhì)粒,摸索其最佳誘導的條件,并用SDS-PAGE技術(shù)檢測重組蛋白表達情況。 2.純化PorB蛋白：經(jīng)SDS-PAGE技術(shù)檢測結(jié)果顯示,pGEX4T-PorB融合蛋白以包涵體的形式表達。因此本實驗要純化包涵體,主要方法為分別用反復凍融后的超聲處理法和化學處理法去裂解菌體,將裂解的菌體純化洗滌,其中包括用TritonX-100提取純化包涵體和用不同濃度的尿素提取純化包涵體,通過調(diào)整洗滌純化的條件使純化出的PorB蛋白純度提高,然后把經(jīng)洗滌純化的包涵體溶解,根據(jù)SDS-PAGE技術(shù)檢測結(jié)果分析其溶解程度,充分溶解,則進行下一步的復性處理及純化,不能充分溶解,則用切膠純化和切膠透析純化的方法純化PorB蛋白。 3. Western印跡初步鑒定了PorB蛋白的抗原性：在Western印跡鑒定的過程中,一抗、二抗的濃度會影響Western檢測效果,出現(xiàn)非特異性條帶,而適合的抗體濃度會減少非特異性條帶的產(chǎn)生,故本實驗應調(diào)整摸索一抗、二抗的的最佳濃度。 結(jié)果 1.在本實驗室已摸索的IPTG終濃度為1.0mmol/L和溫度為37℃的基礎上,分別以不同時間誘導表達pGEX4T-PorB重組蛋白,發(fā)現(xiàn)在誘導5h后的pGEX4T-PorB表達產(chǎn)物沉淀在56KDa位置高水平表達并趨于飽和。 2.根據(jù)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示：經(jīng)誘導含pGEX4T-PorB的大腸桿菌誘導表達產(chǎn)物的沉淀在56KDa位置出現(xiàn)預期大小的目的條帶,而經(jīng)誘導的含pGEX4T-PorB的大腸桿菌誘導表達產(chǎn)物的上清在中含量很少,由此確定PorB融合蛋白為包涵體性表達。 3.通過SDS-PAGE電泳分析；通過調(diào)整洗滌純化的條件得到了純度較高的PorB蛋白,分子量約56kDa。在不能充分溶解的情況下,分別用切膠純化和切膠透析純化的方法純化出了高純度的PorB蛋白,分子量約56kDa。 4.通過Western印跡初步鑒定了PorB蛋白的抗原性,并摸索抗體濃度為一抗1：5000；二抗1：500。 結(jié)論 通過優(yōu)化誘導條件,成功誘導了pGEX4T-PorB融合蛋白的高水平表達,確定了PorB融合蛋白為包涵體性表達,以包涵體的形式純化出了高純度的PorB蛋白,并通過Western印跡初步鑒定了PorB蛋白的抗原性,本實驗為進一步研究PorB蛋白的生物活性,抗原性、免疫保護性、和淋球菌致病機制提供實驗和理論依據(jù)。
【學位授予單位】：大理學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.16;Q78

【參考文獻】

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