本文關(guān)鍵詞：淋病奈瑟菌PorB重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化及其抗原性的初步研究

  更多相關(guān)文章： 淋病奈瑟菌 PorB 表達(dá) 包涵體 純化

【摘要】：研究目的 誘導(dǎo)pGEX4T-PorB原核表達(dá)載體,使其在宿主菌E. coliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá),并純化PorB蛋白,通過(guò)Western印跡初步鑒定PorB蛋白的抗原性,為進(jìn)一步研究其抗原性、免疫保護(hù)性及免疫動(dòng)物模型提供科學(xué)依據(jù)。 研究方法 1. pGEX4T-PorB原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)和檢測(cè)：用異丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)室己構(gòu)建的pGEX-4T-PorB重組質(zhì)粒,摸索其最佳誘導(dǎo)的條件,并用SDS-PAGE技術(shù)檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況。 2.純化PorB蛋白：經(jīng)SDS-PAGE技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,pGEX4T-PorB融合蛋白以包涵體的形式表達(dá)。因此本實(shí)驗(yàn)要純化包涵體,主要方法為分別用反復(fù)凍融后的超聲處理法和化學(xué)處理法去裂解菌體,將裂解的菌體純化洗滌,其中包括用TritonX-100提取純化包涵體和用不同濃度的尿素提取純化包涵體,通過(guò)調(diào)整洗滌純化的條件使純化出的PorB蛋白純度提高,然后把經(jīng)洗滌純化的包涵體溶解,根據(jù)SDS-PAGE技術(shù)檢測(cè)結(jié)果分析其溶解程度,充分溶解,則進(jìn)行下一步的復(fù)性處理及純化,不能充分溶解,則用切膠純化和切膠透析純化的方法純化PorB蛋白。 3. Western印跡初步鑒定了PorB蛋白的抗原性：在Western印跡鑒定的過(guò)程中,一抗、二抗的濃度會(huì)影響Western檢測(cè)效果,出現(xiàn)非特異性條帶,而適合的抗體濃度會(huì)減少非特異性條帶的產(chǎn)生,故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)調(diào)整摸索一抗、二抗的的最佳濃度。 結(jié)果 1.在本實(shí)驗(yàn)室已摸索的IPTG終濃度為1.0mmol/L和溫度為37℃的基礎(chǔ)上,分別以不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)pGEX4T-PorB重組蛋白,發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)5h后的pGEX4T-PorB表達(dá)產(chǎn)物沉淀在56KDa位置高水平表達(dá)并趨于飽和。 2.根據(jù)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示：經(jīng)誘導(dǎo)含pGEX4T-PorB的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的沉淀在56KDa位置出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶,而經(jīng)誘導(dǎo)的含pGEX4T-PorB的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的上清在中含量很少,由此確定PorB融合蛋白為包涵體性表達(dá)。 3.通過(guò)SDS-PAGE電泳分析；通過(guò)調(diào)整洗滌純化的條件得到了純度較高的PorB蛋白,分子量約56kDa。在不能充分溶解的情況下,分別用切膠純化和切膠透析純化的方法純化出了高純度的PorB蛋白,分子量約56kDa。 4.通過(guò)Western印跡初步鑒定了PorB蛋白的抗原性,并摸索抗體濃度為一抗1：5000；二抗1：500。 結(jié)論 通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件,成功誘導(dǎo)了pGEX4T-PorB融合蛋白的高水平表達(dá),確定了PorB融合蛋白為包涵體性表達(dá),以包涵體的形式純化出了高純度的PorB蛋白,并通過(guò)Western印跡初步鑒定了PorB蛋白的抗原性,本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究PorB蛋白的生物活性,抗原性、免疫保護(hù)性、和淋球菌致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：大理學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.16;Q78

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

1 劉繁榮;閆平;;184例淋病的臨床治療體會(huì)[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2010年16期

2 錢可瓊;;臨床實(shí)驗(yàn)室淋病奈瑟菌檢測(cè)方法探討[J];臨床合理用藥雜志;2010年20期

3 秦勇;胡四海;張愉快;余敏君;唐瑩;劉剛;;淋球菌nspA和大腸桿菌ltB融合基因的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定[J];微生物學(xué)報(bào);2008年02期

4 戴志兵;胡四海;陳敏;陸春雪;王玉峰;劉清南;張愉快;余敏君;朱翠明;李忠玉;;淋球菌porB和大腸桿菌ltB融合基因的構(gòu)建、表達(dá)及其免疫活性[J];微生物學(xué)報(bào);2010年04期

5 陳恒;占利;謝志梅;葉盛;左浩江;裴曉方;;淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株外膜蛋白NspA基因重組質(zhì)粒構(gòu)建和生物信息分析[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2008年22期

6 廖芳,李雍龍,宋啟發(fā),崔斌,熊萍;淋球菌膜蛋白疫苗的研究[J];中國(guó)婦幼保健;2004年12期

7 紀(jì)麗君;鄒玉蘭;;兒童感染淋病1例分析報(bào)告[J];中國(guó)社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專業(yè));2010年34期

8 孫愛(ài)華;羅冬嬌;胡美多;周曉輝;嚴(yán)杰;;淋病奈瑟菌臨床菌株P(guān)Ⅰ基因型及PⅠB基因點(diǎn)突變分析[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2006年09期

9 戴志兵;胡四海;劉清南;陳敏;王玉峰;張愉快;余敏君;朱翠明;李忠玉;陸春雪;;抗淋病LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)免疫應(yīng)答的研究[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2010年12期

，

本文編號(hào)：1154948