本文關(guān)鍵詞：大鼠脂肪源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定及Myocardin基因重組慢病毒載體的構(gòu)建

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【摘要】：研究背景 勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)是成年男性最常見的性功能障礙,隨著年齡的增加和基礎(chǔ)疾病的增多ED的發(fā)病率明顯增高。糖尿病與ED的相關(guān)性早已被人們所認(rèn)可,糖尿病人群發(fā)生ED的概率是非糖尿病人群的3倍,發(fā)病率達到35%-90%。糖尿病性ED的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程,因此其在治療上存在巨大的困難,很大一部分糖尿病性ED患者對一線藥物(磷酸二酯酶抑制劑)不敏感,而又不能或不愿意接受二線和三線治療方案,因此,進一步研究糖尿病性ED的病理生理、尋找其他有效的治療措施、發(fā)展個體化治療具有重要的意義。在陰莖勃起過程中,陰莖海綿體平滑肌作為各種因素作用的終末組織,具有重要的核心地位。有研究表明,糖尿病患者陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡增加及增殖率降低,繼而陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,同時細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化,使陰莖海綿體組織順應(yīng)性下降,進而誘發(fā)ED。因此,增加糖尿病患者陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞數(shù)量和修復(fù)細(xì)胞功能,改善陰莖海綿體組織功能可能作為提高糖尿病性ED防治水平的重要途徑。 與心血管平滑肌細(xì)胞相似,陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為收縮型和增殖型。收縮型細(xì)胞主要功能是控制細(xì)胞的收縮和舒張,維持組織器官正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能,增殖型細(xì)胞主要功能是細(xì)胞的增生、分泌、遷移及降解胞外蛋白等。陰莖海綿體組織是一種特殊的血管組織,由兩個較大的血竇組成,血竇的小梁中平滑肌細(xì)胞和心血管平滑肌細(xì)胞在功能上非常相似。本課題組近年來發(fā)現(xiàn)在糖尿病性ED組大鼠陰莖海綿體組織及其體外培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞中海綿體平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,由收縮型轉(zhuǎn)化為增殖型,細(xì)胞舒縮功能受損。 干細(xì)胞(stem cell)是具有多向分化潛能和自我復(fù)制功能的未分化細(xì)胞的統(tǒng)稱,按其來源分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cell, ADSCs)是成體干細(xì)胞的一種,具有分化為多種細(xì)胞的潛能,在特定條件下可被誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等。ADSCs具有取材容易、獲得率高、對組織損傷較小等優(yōu)點,因此在再生醫(yī)學(xué)中占據(jù)重要的地位,可為組織工程提供可靠的細(xì)胞來源,為臨床應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。 Myocardin又稱為心肌素,是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子,在平滑肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,Myocardin直接與血清效應(yīng)因子(serum response factor, SRF)相結(jié)合,激活一系列受SRF調(diào)控、可編碼細(xì)胞骨架蛋白和收縮蛋白的基因轉(zhuǎn)錄。最近研究表明,Myocardin對脂肪源干細(xì)胞分化也起作用,經(jīng)過Myocardin基因修飾后的脂肪源干細(xì)胞可以向具有舒縮功能的平滑肌樣細(xì)胞分化,因此課題組希望進一步研究：通過轉(zhuǎn)基因的方法,選擇合適的表達載體,將Myocardin基因?qū)氪笫驛DSCs中,使其在細(xì)胞內(nèi)長期、穩(wěn)定地表達,并將修飾后的ADSCs作為種子細(xì)胞移植到大鼠陰莖海綿體內(nèi),能否在改善治療區(qū)域細(xì)胞外環(huán)境和局部組織功能的同時,又能發(fā)揮ADSCs的多向分化潛能,在Myocardin的作用下分化為具有舒縮功能的平滑肌樣細(xì)胞,通過增加陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞數(shù)量及修復(fù)細(xì)胞舒縮功能,有望進一步改善糖尿病性ED大鼠陰莖勃起功能。在進行動物實驗之前,首先需要具備成熟脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),在短期內(nèi)能獲得大量純度高、活性強、適合進行基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,其次需要構(gòu)建穩(wěn)定可靠的過表達大鼠Myocardin基因重組慢病毒載體,本課結(jié)合國內(nèi)外同行的經(jīng)驗,根據(jù)課題組的需要,總結(jié)出了一套較為成熟的大鼠脂肪源干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定的方法,并成功構(gòu)建大鼠Myocardin基因重組慢病毒載體,為課題組進一步的研究工作奠定了堅實的基礎(chǔ)。 目的 1、以SD大鼠為研究對象,旨在從大鼠脂肪組織中分離出脂肪干細(xì)胞(ADSCs),并通過體外培養(yǎng)觀察其生長形態(tài),生長方式以及生長曲線等生物學(xué)特征,誘導(dǎo)其定向分化,并檢測分化相關(guān)標(biāo)記物予以鑒定,建立大鼠脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)模型。 2、通過病毒包裝建立大鼠Myocardin基因重組慢病毒載體,為后續(xù)的工作打下良好基礎(chǔ)。 方法 1.大鼠脂肪干細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取8周齡SPF級雄性SD大鼠1只,麻醉后采用附睪旁取材法取附睪旁脂肪組織,取材后縫合切口,可繼續(xù)飼養(yǎng)動物,去除肉眼可見血管、筋膜組織,PBS漂洗、剪碎后加入2倍體積0.1%Ⅰ型膠原酶,37℃、120r/min震蕩消化60min,用等體積含10%FBS的DMEM終止消化,1500r/min離心8min,棄上清和消化未完全的脂肪組織,沉淀物用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后,用100um細(xì)胞篩網(wǎng)過濾以除去細(xì)胞團塊。收集濾液,細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng)。24h后首次更換培養(yǎng)基,除去未貼壁細(xì)胞和剩余血細(xì)胞,后每2-3d換液一次,每日在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生長狀況,并予以拍照。 2、大鼠ADSCs的傳代培養(yǎng) 細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底80%時,用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,制成細(xì)胞懸液。用計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞懸液濃度,以合適細(xì)胞濃度,通常為1×105-3×105個/m1,接種于2-3個新培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中,即按照1：3傳代培養(yǎng)。 3、MTT法檢測大鼠ADSCs的增殖 取生長滿培養(yǎng)瓶底80%時的第3、6代ADSCs,消化離心,以1×103～1×104/孔密度接種于96孔板上,自接種后24h每d取出其中3孔進行MTT比色,連續(xù)7d,每隔3d換液1次。以時間為橫軸、0D平均值為縱軸繪制生長曲線。 4、大鼠ADSCs的凍存和復(fù)蘇 取生長滿培養(yǎng)瓶底80%時的第3代ADSCs,消化離心后加入凍存管中,細(xì)胞密度為5×105/m1,凍存液配制比例為DMSO:胎牛血清：基礎(chǔ)培養(yǎng)液=1：2：7。4℃放置1h,-20℃放置2h,-80℃放置過夜,保存在液氮中。1個月后復(fù)蘇,將凍存管從液氮中取出,立即置于37℃水浴并輕輕搖動使其迅速解凍。加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋、離心、去上清2次,接種至培養(yǎng)瓶內(nèi),并進行存活率測定(即用0.4%臺盼藍(lán)染液測定),成骨、成脂誘導(dǎo)分化等實驗。 5、多向分化潛能檢測 用特定的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系誘導(dǎo)ADSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞兩個方向分化,并分別采用茜素紅染色及油紅0染色鑒定定向分化結(jié)果。 6、ADSCs表面分子的檢測 取生長狀態(tài)良好的第3代ADSCs,制成單細(xì)胞懸液,密度為1×106個/m1,加入兔抗鼠CD29-PE、CD44-FITC單克隆抗體工作液100u1,設(shè)立對照,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子,EXP032.V1.2軟件分析。 7、大鼠Myocardin基因重組慢病毒載體的構(gòu)建 采用全基因合成的方法人工合成全長序列為2832bp的目的基因大鼠Myocardin基因,構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo-myocardin。大量提取pLVX-IRES-Neo-myocardin質(zhì)粒,將攜帶目的基因大鼠myocardin的慢病毒表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞可包裝出含有目的基因的慢病毒顆粒lenti-myocardin。測定慢病毒顆粒Lenti-myocardin滴度,并將慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染至大鼠ADSCs,通過RT-PCR和Western blot技術(shù),檢測大鼠Myocardin基因在大鼠ADSCs中mRNA和蛋白水平的過表達效果。 結(jié)果 1、大鼠ADSCs的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察,原代大鼠ADSCs接種后4-6小時開始貼壁,24h內(nèi)多數(shù)已貼壁并開始伸展,7d左右,鏡下可見大量成纖維樣細(xì)胞的生長并且細(xì)胞排列具有一定的方向性,8d左右細(xì)胞可達80%～90%單層融合,傳代后細(xì)胞呈梭形,突起減少,細(xì)胞大小及形態(tài)較為一致,增殖速度比原代細(xì)胞迅速,一般3～4d即可形成80%單層融合,細(xì)胞仍呈成纖維細(xì)胞樣生長,呈束狀及漩渦狀排列。傳6代后,細(xì)胞仍呈束狀及漩渦狀排列,增生活躍,傳10代以后,細(xì)胞的增殖速度未見明顯減慢,細(xì)胞仍然保持旺盛的增殖能力和均一的長梭樣形態(tài)學(xué)特征,未見細(xì)胞在傳代過程中自發(fā)形成胞漿內(nèi)脂滴。 2、大鼠ADSCs生長曲線繪制 第3、5、7代大鼠ADSC生長曲線均呈“S”形,均在第1、2d為生長適應(yīng)期,2d后細(xì)胞生長加速,呈對數(shù)增長,第6d達到生長峰值后,細(xì)胞增殖速率下降,進入平臺期,第3、5代大鼠ADSCs增殖速率較第7代快。 3、大鼠ADSCs的凍存和復(fù)蘇 1個月后將凍存的第3代ADSCs復(fù)蘇,測定細(xì)胞存活率為79%,復(fù)蘇后細(xì)胞生長形態(tài)良好,呈長梭形成纖維樣生長,培養(yǎng)至第3d即可傳代,增殖能力與凍存前相比無明顯降低,成脂和成骨誘導(dǎo)分化也獲得成功。 4、多向分化潛能檢測 成骨誘導(dǎo)14d后,倒置顯微鏡下觀察可見多數(shù)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,多由長梭形變?yōu)槎趟笮?出現(xiàn)橢圓形和多角形細(xì)胞,細(xì)胞核變大變圓,胞漿中可見較多的細(xì)小黑色顆粒細(xì)胞,形成大小不一的顆粒狀結(jié)節(jié)。取成骨誘導(dǎo)28d后的細(xì)胞經(jīng)茜素紅染色可見：在集落生長的細(xì)胞中央?yún)^(qū),細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)黑色團塊狀磷酸鹽沉淀,對照組茜素紅染色陰性。 成脂誘導(dǎo)7d后,倒置顯微鏡下可見少量細(xì)胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)高折光性的圓形小脂滴,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,由原來的長梭形逐漸變圓。隨誘導(dǎo)時間的延長,出現(xiàn)脂滴的細(xì)胞逐漸增多。誘導(dǎo)14d后,細(xì)胞體積增大,胞漿內(nèi)充滿圓形脂滴,行油紅0染色可見：圓形細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色的顆粒,證明胞漿內(nèi)容物為脂肪滴。對照組無明顯變化,仍為梭形細(xì)胞成纖維樣生長,未見胞漿內(nèi)脂滴,油紅0染色陰性。 5、ADSCs的表面分子檢測 大鼠ADSCs進行CD29.CD44分子流式細(xì)胞儀檢測,可見ADSCs中CD29和CD44分子陽性率高,CD29陽性率87.2%、CD44陽性率93.5%。 6、大鼠Myocardin基因重組慢病毒載體的構(gòu)建 結(jié)果顯示大鼠myocardin蛋白在大鼠脂肪源干細(xì)胞成功過表達,同時說明了攜帶大鼠myocardin基因的慢病毒顆粒Lenti-myocardin已構(gòu)建成功。 結(jié)論 1、附睪旁脂肪組織取材法優(yōu)于其他部位的取材法,易于取得大量的ADSCs,所取組織不易受到細(xì)菌污染,可多只動物同時取材； 2、本實驗所分離的大鼠ADSCs生長形態(tài)良好,與文獻報道一致； 3、經(jīng)形態(tài)學(xué)、干細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測以及定向分化誘導(dǎo)實驗鑒定,所分離的細(xì)胞為大鼠ADSCs; 4、通過繪制細(xì)胞生長曲線、觀察傳代后各代細(xì)胞生長速度及形態(tài)可得出結(jié)論：第3、5代大鼠ADSCs增殖速率較第7代快,因此3-5代大鼠ADSCs較適合在大規(guī)模動物實驗中使用； 5、成功構(gòu)建了攜帶大鼠Myocardin基因的慢病毒載體。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

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9 劉偉;小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

10 張曉宇;含LfcinB基因慢病毒載體的構(gòu)建及體外對SKOV3細(xì)胞作用的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

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本文編號：1155261