本文關鍵詞：細胞穿膜肽TAT與誘導多功能干細胞相關轉(zhuǎn)錄因子的融合表達及其穿膜能力研究

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【摘要】：將外源基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc導入成體細胞使其重編程，產(chǎn)生具有類似于干細胞性質(zhì)的誘導多功能干細胞（iPS）是近期干細胞研究的熱點。然而基于病毒技術將外源基因插入細胞基因組存在致瘤的風險，因此制約iPS的臨床應用。本文利用細胞穿膜肽TAT可高效介導蛋白進入細胞的特點，設計并制備了TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog融合蛋白，并評價了其穿透細胞能力，為獲得更為安全的iPS奠定了基礎。 首先擴增獲得TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4目的基因，利用重疊PCR技術將細胞穿膜肽TAT與c-Myc、Nanog基因片段融合，獲得TAT-c-Myc、TAT-Nanog目的基因。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切，插入pET28a表達載體，構(gòu)建相關的重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證與理論序列一致。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)原核表達菌株，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，，分別獲得表達TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog的重組工程菌。 SDS-PAGE結(jié)果顯示，TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog在大腸桿菌中主要以不溶性包涵體形式表達。包涵體在變性條件下利用鎳柱純化，最終產(chǎn)物純度可達90%以上。采用添加精氨酸、甘油、GSH/GSSG等的尿素梯度透析復性方法獲得具有活性的TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog目的蛋白，其平均復性收率分別為8.8%、51.0%、47.9%、67.2%、8.5%。 免疫熒光分析結(jié)果顯示，5種帶有細胞穿膜肽TAT的融合蛋白可穿透近100%受試細胞的細胞膜。同時確定TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog作用細胞的最佳濃度分別為6μg/mL、8μg/mL、8μg/mL、8μg/mL、4μg/mL。為了進一步分析各個蛋白在細胞內(nèi)相對量，流式細胞儀分析結(jié)果顯示，各個蛋白的熒光強度值分別為37.5、44.5、38.7、44.7、64.7，其相對熒光強度為16.6%、20.6%、17.3%、20.7%、33.2%。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416

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