本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞穿膜肽TAT與誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的融合表達(dá)及其穿膜能力研究

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【摘要】：將外源基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc導(dǎo)入成體細(xì)胞使其重編程，產(chǎn)生具有類似于干細(xì)胞性質(zhì)的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS）是近期干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。然而基于病毒技術(shù)將外源基因插入細(xì)胞基因組存在致瘤的風(fēng)險(xiǎn)，因此制約iPS的臨床應(yīng)用。本文利用細(xì)胞穿膜肽TAT可高效介導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并制備了TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog融合蛋白，并評(píng)價(jià)了其穿透細(xì)胞能力，為獲得更為安全的iPS奠定了基礎(chǔ)。 首先擴(kuò)增獲得TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4目的基因，利用重疊PCR技術(shù)將細(xì)胞穿膜肽TAT與c-Myc、Nanog基因片段融合，獲得TAT-c-Myc、TAT-Nanog目的基因。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切，插入pET28a表達(dá)載體，構(gòu)建相關(guān)的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與理論序列一致。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)原核表達(dá)菌株，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，，分別獲得表達(dá)TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog的重組工程菌。 SDS-PAGE結(jié)果顯示，TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog在大腸桿菌中主要以不溶性包涵體形式表達(dá)。包涵體在變性條件下利用鎳柱純化，最終產(chǎn)物純度可達(dá)90%以上。采用添加精氨酸、甘油、GSH/GSSG等的尿素梯度透析復(fù)性方法獲得具有活性的TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog目的蛋白，其平均復(fù)性收率分別為8.8%、51.0%、47.9%、67.2%、8.5%。 免疫熒光分析結(jié)果顯示，5種帶有細(xì)胞穿膜肽TAT的融合蛋白可穿透近100%受試細(xì)胞的細(xì)胞膜。同時(shí)確定TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog作用細(xì)胞的最佳濃度分別為6μg/mL、8μg/mL、8μg/mL、8μg/mL、4μg/mL。為了進(jìn)一步分析各個(gè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)相對(duì)量，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，各個(gè)蛋白的熒光強(qiáng)度值分別為37.5、44.5、38.7、44.7、64.7，其相對(duì)熒光強(qiáng)度為16.6%、20.6%、17.3%、20.7%、33.2%。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416

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