本文關(guān)鍵詞：NGF促進(jìn)海馬神經(jīng)再生過程中Brn-4、Lhx8的表達(dá)變化

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【摘要】：目的：探討NGF促進(jìn)海馬神經(jīng)再生、神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元分化過程中,POU同源盒基因Brn-4和LIM同源盒基因Lhx8的表達(dá)變化,以及海馬新生神經(jīng)元過表達(dá)Lhx8后向膽堿能神經(jīng)元分化的情況。 方法： 實(shí)驗(yàn)一：1.SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、切割組、NGF組、NGF聯(lián)合切割組,每組18只；切割組大鼠切割右側(cè)穹窿海馬傘,NGF組大鼠側(cè)腦室注射NGF,NGF聯(lián)合切割組在切割右側(cè)穹窿海馬傘的基礎(chǔ)上側(cè)腦室注射NGF；2.分離各組6只SD大鼠海馬組織,提取總RNA,合成第一鏈cDNA, Real-time PCR檢測(cè)Brn-4基因的表達(dá)變化；3.分離各組6只大鼠海馬組織,提取總蛋白并定量,Western blot檢測(cè)Brn-4蛋白的表達(dá)變化；4.各組6只SD大鼠灌注取腦、冰凍切片后,行Brn-4/BrdU/NeuN免疫熒光檢測(cè)和Hoechst細(xì)胞核標(biāo)記；5.體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細(xì)胞,分為對(duì)照組、正常組(含5%正常海馬提取液)、切割組(含5%切割側(cè)海馬提取液)、NGF組(含20ng/ml的NGF)、NGF+正常組(含20ng/ml的NGF和5%正常海馬提取液)、NGF+切割組(含20ng/ml的NGF和5%切割側(cè)海馬提取液),培養(yǎng)7d：6.提取各組細(xì)胞的總RNA,合成第一鏈cDNA, Real-time PCR檢測(cè)Brn-4基因表達(dá)變化；7.提取各組細(xì)胞總蛋白,Western blot檢測(cè)Brn-4蛋白的表達(dá)變化；8.免疫熒光檢測(cè)各組DCX/Brn-4雙標(biāo)神經(jīng)元數(shù)；9.圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)二：1.SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、切割組、NGF組、NGF聯(lián)合切割組,每組各18只：切割組大鼠切割右側(cè)穹窿海馬傘,NGF組大鼠側(cè)腦室注射NGF,NGF聯(lián)合切割組在切割右側(cè)穹窿海馬傘的基礎(chǔ)上側(cè)腦室注射NGF；2.分離各組6只海馬組織,提取總RNA,合成第一鏈cDNA, Real-time PCR檢測(cè)Lhx8基因的表達(dá)變化；3.分離各組6只大鼠海馬組織,提取總蛋白, Western blot檢測(cè)Lhx8蛋白的表達(dá)變化；4.各組6只SD大鼠灌注取腦、冰凍切片后,行ChAT/Lhx8免疫熒光檢測(cè)和Hoechst細(xì)胞核標(biāo)記：5.體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細(xì)胞,分為對(duì)照組、正常組(含5%正常海馬提取液)、切割組(含5%切割側(cè)海馬提取液)、NGF組(含50ng/ml的NGF)、NGF+正常組(含50ng/ml的NGF和5%正常海馬提取液)、NGF+切割組(含50ng/ml的NGF和5%切割側(cè)海馬提取液),培養(yǎng)14d；6.提取各組細(xì)胞的總RNA,合成第一鏈cDNA, Real-time PCR檢測(cè)Lhx8基因表達(dá)變化；7.提取各組細(xì)胞總蛋白,Western blot檢測(cè)Lhx8蛋白的表達(dá)變化；8.免疫熒光檢測(cè)各組ChAT/Lhx8雙標(biāo)神經(jīng)元數(shù)；9.圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)三：1.體外培養(yǎng)海馬新生神經(jīng)元分為對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組,分別加入陰性對(duì)照慢病毒和Lhx8過表達(dá)慢病毒,培養(yǎng)5d；2.提取兩組細(xì)胞的總RNA,合成第一鏈cDNA, Real-time PCR檢測(cè)Lhx8基因表達(dá)變化；3.提取兩組細(xì)胞總蛋白,Western blot檢測(cè)Lhx8蛋白的表達(dá)變化；4.免疫熒光檢測(cè)兩組細(xì)胞中EGFP/ChAT/VAChT三標(biāo)神經(jīng)元數(shù)；5.圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)一：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：1. Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果提示,NGF聯(lián)合切割組中Brn-4的基因表達(dá)量較其他三組明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；2.Western blot檢測(cè)結(jié)果提示,NGF組中Brn-4蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組及切割組明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); NGF聯(lián)合切割組中Brn-4蛋白表達(dá)量較其他三組明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01)；3.對(duì)照組海馬齒狀回顆粒下層及門區(qū)中僅見少量的Brn-4/BrdU/NeuN的三標(biāo)細(xì)胞,切割組和NGF組中Brn-4/BrdU/NeuN三標(biāo)的陽性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01)；NGF聯(lián)合切割組中的三標(biāo)細(xì)胞增高更為明顯,與其他三組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01或P0.001)。體外細(xì)胞培養(yǎng)：1. Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果提示切割組、NGF組、NGF+正常組、NGF+切割組中Brn-4基因的表達(dá)量較對(duì)照組及正常組明顯增高(P0.05),而上述四組之間無明顯差異；2.Western blot結(jié)果提示,切割組、NGF組、NGF+正常組、NGF+切割組中Brn-4蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組及正常組明顯增高(P0.01)；NGF組、NGF+正常組、NGF+切割組中Brn-4蛋白的表達(dá)量較切割組明顯增高(P0.05),但三組之間無明顯差異；3.切割組、NGF組、NGF+正常組、NGF+切割組中DCX/Brn-4雙標(biāo)的陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組及正常組明顯增多(P0.01或P0.001)；NGF組、NGF+正常組、NGF+切割組中DCX/Brn-4陽性細(xì)胞數(shù)又較切割組明顯增多(P0.05或P0.01),而三組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)二：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：1. Real-time PCR提示NGF組中Lhx8基因的表達(dá)量較正常組和切割組明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01); NGF聯(lián)合切割組中Lhx8基因的表達(dá)量明顯高于其他各組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；2.Western blot結(jié)果提示切割組、NGF組、NGF聯(lián)合切割組中Lhx8蛋白的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P0.05或P0.01)；NGF組和NGF聯(lián)合切割組中Lhx8蛋白的表達(dá)量又高于切割組(P0.05)；3.對(duì)照組海馬齒狀回顆粒下層和門區(qū)中幾乎檢測(cè)不到ChAT/Lhx8雙標(biāo)細(xì)胞,切割組齒狀回顆粒下層和門區(qū)中可檢測(cè)到少量ChAT/Lhx8雙標(biāo)細(xì)胞；NGF組可檢測(cè)到較多的ChAT/Lhx8雙標(biāo)細(xì)胞,與對(duì)照組及切割組比較明顯增多(P0.001)；NGF聯(lián)合切割組中ChAT/Lhx8雙標(biāo)細(xì)胞最多、明顯高于其他三組(P0.05,P0.01或P0.001)。體外細(xì)胞培養(yǎng)：1.Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果提示切割組、NGF組、NGF+正常組、NGF+切割組中Lhx8基因的表達(dá)量較對(duì)照組及正常組明顯增高(P0.05或P0.01),NGF+切割組中Lhx8基因的表達(dá)量明顯高于NGF組OP0.05);2.Western blot結(jié)果提示切割組、NGF組、NGF+正常組、NGF+切割組中Lhx8蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組及正常組明顯增高(P0.05或P0.01); NGF+切割組中Lhx8蛋白的表達(dá)量較切割組明顯增高(P0.05)；6.正常組、切割組、NGF組、NGF+正常組、NGF+切割組中ChAT/Lhx8雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組明顯增多(P0.05,P0.001或P0.001):NGF+切割組中ChAT/Lhx8雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)又較NGF組明顯增多(P0.05),而與NGF+正常組比較無顯著性差異。 實(shí)驗(yàn)三：1. Real-time PCR結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染組中Lhx8基因的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2.Western blot結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染組中Lhx8的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；3.對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組均有細(xì)胞表達(dá)EGFP以及膽堿能神經(jīng)元標(biāo)記物ChAT和VAChT,轉(zhuǎn)染組中ChAT/VAChT雙標(biāo)的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目明顯多于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 結(jié)論： 1.側(cè)腦室灌注NGF能夠提高神經(jīng)再生海馬組織中Brn-4和Lhx8mRNA和蛋白的表達(dá)水平,并促進(jìn)海馬NSCs向神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元分化；2.體外細(xì)胞培養(yǎng)中,NGF促進(jìn)海馬NSCs向神經(jīng)元分化過程中Brn-4表達(dá)增高,向膽堿能神經(jīng)元分化過程中Lhx8表達(dá)增高；3.海馬新生神經(jīng)元轉(zhuǎn)染Lhx8基因使其過表達(dá),可促進(jìn)其向膽堿能神經(jīng)元分化；4.Brn-4和Lhx8高表達(dá)與海馬神經(jīng)再生和膽堿能神經(jīng)再生有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R33

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 董傳明;金國(guó)華;秦建兵;田美玲;鄒琳清;譚雪鋒;朱蕙霞;;神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)穹窿海馬傘切割后海馬自體神經(jīng)干細(xì)胞增殖和向神經(jīng)元分化的影響[J];解剖學(xué)報(bào);2007年06期

2 熊詠;田美玲;秦建兵;朱蕙霞;金國(guó)華;;NGF誘導(dǎo)大鼠胚腦皮層和隔區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和AChE陽性神經(jīng)元分化的作用[J];南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年01期

3 趙善廷,鄧錦波;大鼠海馬結(jié)構(gòu)的組成、細(xì)胞類型及神經(jīng)纖維聯(lián)系 Ⅰ.齒狀回[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;1999年01期

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本文編號(hào)：1151144