本文關(guān)鍵詞：SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立及誘導(dǎo)分化為心肌（樣）細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的：間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs Mesenchymal stem cells)是心肌修復(fù)的理想種子細(xì)胞。本文建立了SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs Bone marrow-mesenchymal stem cells)體外分離培養(yǎng)技術(shù),同時(shí)探討了BMSCs體外誘導(dǎo)為心肌(樣)細(xì)胞的有效方法及如何提高分化效率,通過技術(shù)的建立和初步的機(jī)制研究為今后BMSCs來源的心肌(樣)細(xì)胞在心肌修復(fù)方面的研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、無菌條件下分離4周齡SD大鼠的長骨,用體積分?jǐn)?shù)為10%FBS,DF-12完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,采用經(jīng)典的全骨髓細(xì)胞貼壁法聯(lián)合頻繁換液法和差速消化法,培養(yǎng)SD大鼠BMSCs,自然傳代法體外擴(kuò)增BMSCs。倒置顯微鏡和瑞氏--姬姆薩染色觀察BMSCs的形態(tài)結(jié)構(gòu)；繪制生長曲線了解BMSCs的生長特點(diǎn)和細(xì)胞倍增時(shí)間；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSCs的自我更新能力；使用小鼠抗大鼠的單克隆抗體CD2、CD45、CD90.1,通過流式細(xì)胞技術(shù)鑒定BMSCs的分子表面標(biāo)志FITC-anti-Mouse/Rat CD29、PE-anti-Rat CD45、PE-anti-mouse/rat CD90.1(Thy-1)。 2、用濃度為5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L的5氮雜胞苷(5-Azacytidine、5-AZA)分別誘導(dǎo)體外擴(kuò)增到第四代的大鼠BMSCs,以下簡稱為P4代BMSCs(P4代BMSCs:CD29、CD45、CD90表達(dá)率分別為99.9%、0.8%、99.6%),并設(shè)計(jì)兩組誘導(dǎo)時(shí)間即24小時(shí)和48小時(shí)。通過倒置顯微鏡觀察經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；利用免疫熒光染色鑒定經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞中心肌特異性肌鈣蛋白I(cTnI, Cardiac troponinⅠ)的表達(dá)情況。分析不同濃度的5-AZA在BMSCs體外心肌化效率中的差異,探討體外心肌化的最佳的誘導(dǎo)條件。 3、用濃度為10μmol/L5-AZA分別誘導(dǎo)體外擴(kuò)增到第一代的SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,以下簡稱為P1代BMSCs (P1代BMSCs的CD29、CD45、CD90表達(dá)率分別為100%、14.7%、16.5%,))和P4代BMSCs(P4代BMSCs:CD29、CD45CD90表達(dá)率分別為99.9%、0.8%、99.6%)24小時(shí),對(duì)照組用體積分?jǐn)?shù)為10%FBS,DF-12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)P1代和P4代BMSCs,兩組細(xì)胞分別培養(yǎng)2周和4周。倒置顯微鏡和瑞氏--姬姆薩染色觀察經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫熒光染色鑒定經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞中cTnI的表達(dá)情況。分析不同代數(shù)的BMSCs體外心肌化效率中的差異,從而探討體外心肌化的最佳的誘導(dǎo)條件。 結(jié)果： 1、原代剛分離培養(yǎng)的BMSCs懸浮狀生長、圓形、體積小、數(shù)量多、折光性強(qiáng)。培養(yǎng)4小時(shí)后,進(jìn)行首次換液,去除大量的懸浮的造血干細(xì)胞,部分細(xì)胞完成貼壁,細(xì)胞體積小、呈圓形、細(xì)胞形狀未改變。培養(yǎng)24小時(shí),細(xì)胞完成貼壁,貼壁細(xì)胞形態(tài)不一,呈多角形、短梭形、紡錘體外觀,少數(shù)視野可見1-2個(gè)細(xì)胞集落。細(xì)胞集落由數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成,其上附著的大量造血干細(xì)胞。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,細(xì)胞集落逐步增多、變大,懸浮的造血干細(xì)胞不斷減少。原代培養(yǎng)第5天,彼此靠近的集落完全融合,連接成片,呈放射狀或平行狀排列,鋪滿瓶底的80%左右,可進(jìn)行首次傳代培養(yǎng)。P1代至P4代BMSCs均呈典型紡錘體外觀,旋渦狀排列生長,培養(yǎng)3天左右鋪滿瓶底的80%,可再次傳代,具有良好的增殖能力。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)提示：P1代和P4代BMSCs的克隆形成率分別是10.8%和8.9%。P1代和P4代BMSCs生長曲線呈S形,符合Logistic的生長曲線；其倍增時(shí)間分別為27.7小時(shí)和43.2小時(shí)。流式細(xì)胞技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)P1代和P4代BMSCs的分子表面標(biāo)志：P1代BMSCs CD29、CD45、CD90表達(dá)率分別為100%、14.7%、16.5%；P4代BMSCs的分子表面標(biāo)志CD29、CD45、CD90表達(dá)率分別為99.9%、0.8%、99.6%。 2、用5μmol/L5-AZA誘導(dǎo)P4代BMSCs24小時(shí)或48小時(shí),BMSCs的增殖未受到明顯抑制,細(xì)胞的大小、形態(tài)并未發(fā)生明顯改變,并且免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)4周的細(xì)胞不表達(dá)cTnI;用10μmol/L的5-AZA誘導(dǎo)P4代BMSCs24小時(shí),約20%的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶脫落,其余的BMSCs的增殖明顯受到抑制,細(xì)胞形態(tài)由原來的紡錘體形逐漸變成橢圓形,出現(xiàn)心肌纖維的特征,且免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)4周的細(xì)胞表達(dá)cTnI;用10μmol/L的5-AZA誘導(dǎo)P4代BMSCs48小時(shí),或用15μmol/L的5-AZA誘導(dǎo)P4代BMSCs24小時(shí)或48小時(shí),BMSCs的增殖明顯受到抑制,約75%的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上脫落死亡,其余細(xì)胞由于生長密度過低停止生長。 3、用濃度為10μmol/L的5-AZA分別誘導(dǎo)P1代和P4代BMSCs24小時(shí),P1代和P4代BMSCs形態(tài)均由原來的紡錘體形逐漸變成橢圓形,具有心肌纖維的特征。經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞的cTnI為陽性。P1代和P4代BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞中cTnI的陽性率分別為(23±2)%和(36±3)%,然而僅有P4代BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后可觀察到“肌島”和多核肌管,經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞cTnI的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。 結(jié)論： 1、采用全骨髓細(xì)胞貼壁法聯(lián)合頻繁換液法和差速消化法可在短期內(nèi)獲得生長狀態(tài)良好、增殖能力強(qiáng)、純度較高的BMSCs。 2、5-AZA誘導(dǎo)BMSCs為心肌(樣)細(xì)胞的最佳的工作濃度為10μmol/L,最佳的作用時(shí)間為24小時(shí)。 3、P4代BMSCs有較強(qiáng)的心肌化潛力。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 分化 心肌(樣)細(xì)胞 5-氮雜胞苷
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中英文縮略詞5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 引言12-14
• 第一部分 S D大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立14-29
• 一 實(shí)驗(yàn)材料14-15
• 二 實(shí)驗(yàn)方法15-19
• 三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-26
• 四 討論26-27
• 五 本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)論27-29
• 第二部分 S D大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌(樣)細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究29-43
• 一 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 二 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-40
• 四 討論40-42
• 五 本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)論42-43
• 總結(jié)43-45
• 論文參考文獻(xiàn)45-48
• 文獻(xiàn)綜述48-60
• 綜述參考文獻(xiàn)56-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況60-61
• 致謝61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1064297