本文關鍵詞：miR-302-367簇重組慢病毒載體的構建及其在人臍帶間充質(zhì)干細胞中的表達研究

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【摘要】：目的：本課題用攜帶miR-302-367簇的慢病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs），嘗試將hUCMSCs重編程為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stemcells，iPSCs），為后續(xù)研究奠定基礎。 方法：1)采用組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)hUCMSCs，鏡下觀察細胞的生長情況，流式細胞儀分析細胞周期和細胞表面標志物;2)將miR-302-367簇的基因片段克隆到編碼綠色熒光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)的慢病毒表達載體pLenO-DCE-Puro上，，經(jīng)酶切和測序鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pLenO-DCE-Puro-miR-302-367和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞，收集病毒上清，濃縮并測定病毒滴度；3)先用攜帶GFP的空慢病毒感染hUCMSCs，熒光鏡下觀察GFP的表達情況，流式細胞儀檢測293T細胞中表達GFP+的細胞比例，從而確定最佳感染復數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）；后將攜帶miR-302-367簇的慢病毒感染hUCMSCs，接種到飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，觀察細胞的形態(tài)變化。 結(jié)果：1)體外成功培養(yǎng)出hUCMSCs，細胞呈長梭形成纖維細胞樣；細胞周期結(jié)果示細胞絕大多數(shù)處于G0/G1期(70.15%)，僅少數(shù)處于S期（5.85%）；細胞高表達CD29、CD105和CD90，低表達CD34、CD45；2)成功構建miR-302-367簇慢病毒表達載體pLenO-DCE-Puro-miR-302-367,經(jīng)酶切及測序鑒定為正確克隆，并包裝出慢病毒。其中，重組慢病毒的滴度為2×10~8TU/ml，空白對照慢病毒的滴度為1×10~9TU/ml；3)慢病毒感染hUCMSCs的最佳MOI值為20；感染組中檢測到miR-302-367簇中各成員在細胞中高表達，而陰性對照組和未感染組未檢測到相應表達；感染組中的細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由長梭形逐漸變?yōu)樯掀ぜ毎麡踊驒E圓形，甚至出現(xiàn)克隆團，類似于胚胎干細胞樣的形態(tài)，而其它兩組的細胞無明顯變化，仍為長梭形。 結(jié)論：1)從臍帶中成功分離出hUCMSCs;2)成功構建重組慢病毒載體pLenO-DCE-Puro-miR-302-367,并包裝出高滴度的慢病毒;3)重組慢病毒感染hUCMSCs后，細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，但需進一步優(yōu)化誘導iPSCs的條件。
【關鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細胞 miR-302-367簇 慢病毒 誘導性多能干細胞
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2;Q78
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 第一部分 原代細胞的培養(yǎng)14-21
• 第一節(jié) 人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及其生物學特性14-18
• 1 材料與方法14-16
• 2 結(jié)果16-17
• 3 討論17-18
• 第二節(jié) MEF 飼養(yǎng)層細胞的制備18-21
• 1 材料與方法18-19
• 2 結(jié)果19-20
• 3 討論20-21
• 第二部分 miR-302-367 簇重組慢病毒載體的構建、鑒定及包裝21-28
• 1 材料與方法21-25
• 2 結(jié)果25-26
• 3 討論26-28
• 第三部分 miR-302-367 簇重組慢病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細胞及其對細胞的影響28-34
• 1 材料與方法28-32
• 2 結(jié)果32-33
• 3 討論33-34
• 全文總結(jié)34-35
• 參考文獻35-39
• 附圖39-46
• 文獻綜述46-55
• 參考文獻51-55
• 致謝55-56
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文56-57

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 盧海;張志;趙毅超;饒小惠;江金群;孟鑌;艾民;潘明新;高毅;;CF-1小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層的制備[J];中國組織工程研究;2012年10期

2 葛秋燕;丁利軍;顏桂軍;刁振宇;孫海翔;胡婭莉;;人微小RNA-302s表達載體的構建及其對細胞周期的影響[J];中國細胞生物學學報;2010年03期

本文編號：1050289