本文關(guān)鍵詞：Notch1信號通路在H9c2心肌細胞缺血后處理中對細胞凋亡作用的實驗研究

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【摘要】：目的： 探討Notch1信號通路在H9c2心肌細胞缺血后處理心肌保護中對細胞凋亡的影響，為防治心肌缺血再灌注損傷提供新靶點。 方法： 采用大鼠H9c2心肌細胞構(gòu)建缺氧復(fù)氧模型（H/R）和缺氧后處理模型（H-post），脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myc-His質(zhì)粒和pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRNA干擾質(zhì)粒，上調(diào)和下調(diào)Notch1信號，將H9c2心肌細胞隨機分為6組：Control組，H/R組，N1ICD+H/R組，H-post組，miRNA+H-post組，Mock組。采用流式細胞技術(shù)檢測各組細胞凋亡率，real-time PCR和Western-blotting檢測凋亡基因蛋白Bcl-2和Bax表達變化情況，caspase活性檢測試劑盒檢測caspase-9活性和caspase-3活性。探討Notch1信號通路在心肌缺氧后處理心肌保護中對大鼠心肌細胞凋亡的影響。 結(jié)果： 1.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率測定：與Control組相比，H/R組細胞凋亡率顯著升高（6.21±0.98%和0.8±0.12%），兩者有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；當(dāng)N1ICD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)Notch1信號表達后，N1ICD+H/R組與H/R組相比細胞凋亡率明顯下降（3.10±0.17%和6.21±0.98%），兩者有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；H-post組細胞凋亡率與H/R組相比下降明顯（1.98±0.18%和6.21±0.98%），有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）；miRNA干擾下調(diào)Notch1信號表達后，miRNA+H-post組與H-post組相比，細胞凋亡率明顯增高（6.30±0.26%和1.98±0.18%），有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01)。 2.凋亡基因蛋白Bcl-2和Bax的表達情況：real-time PCR檢測凋亡基因Bcl-2mRNA和Bax mRNA表達水平：H/R組與Control組相比，Bax mRNA表達顯著增加(P 0.05)，Bcl-2mRNA表達顯著降低(P0.05)；H-post組與H/R組相比Bax mRNA表達水平顯著降低(P0.05)，Bcl-2mRNA顯著增加(P0.05)；miRNA+H-post組與H-post組相比，Bax mRNA明顯高，而Bcl-2mRNA明顯降低(P0.01)；N1ICD+H/R組與H/R組相比Bax mRNA表達水平顯著降低(P0.05)，Bcl-2mRNA顯著增加(P0.05)。通過Western-blotting檢測其蛋白表達情況，蛋白表達與相應(yīng)mRNA表達相一致。 3.Caspase活性檢測結(jié)果：與Control組相比，H/R組caspase-9和caspase-3活性明顯增高(P0.05),通過N1ICD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,上調(diào)Notch1信號表達，N1ICD+H/R組與H/R組相比，，N1ICD+H/R組caspase-9和caspase-3活性顯著降低(P0.05)，H-post組與H/R組相比, H-post組caspase-9和caspase-3活性明顯降低(P0.05)，通過miRNA干擾下調(diào)Notch1信號表達，miRNA+H-post組與H-post組相比，miRNA+H-post組caspase-9和caspase-3活性明顯增高(P0.05)。 結(jié)論： Notch1信號通路可通過抑制細胞凋亡線粒體途徑，減輕細胞凋亡的發(fā)生，在心肌缺氧后處理中起到心肌保護作用。
【關(guān)鍵詞】：Notch信號通路 缺血后處理 心肌保護 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 引言10-13
• 第2章 材料與方法13-27
• 2.1 細胞株13
• 2.2 pcDNA3.1-Myc-His 質(zhì)粒和 pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miRNA 質(zhì)粒13
• 2.2.1 Notch1 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域真核表達質(zhì)粒13
• 2.2.2 Notch1 miRNA 干擾質(zhì)粒13
• 2.3 實驗試劑13-18
• 2.3.1 主要購買試劑13-14
• 2.3.2 主要配置試劑14-18
• 2.4 實驗儀器18-19
• 2.5 方法19-20
• 2.6 大鼠心肌細胞 H/R 和 H-post 模型的制備20
• 2.7 細胞轉(zhuǎn)染20-21
• 2.8 實驗分組21-22
• 2.9 流式細胞技術(shù)檢測心肌細胞凋亡22-23
• 2.10 real-time PCR 檢測凋亡基因 Bcl-2 mRNA 和 Bax mRNA 表達變化23-25
• 2.10.1 引物設(shè)計23
• 2.10.2 H9c2 心肌細胞總 RNA 提取23-24
• 2.10.3 H9c2 心肌細胞總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA24
• 2.10.4 real-time PCR 檢測 Bcl-2 mRNA 和 Bax mRNA 表達變化24-25
• 2.11 Western-blotting 技術(shù)檢測凋亡基因蛋白 Bcl-2 和 Bax 表達變化25-26
• 2.12 caspase 蛋白活性測定26
• 2.13 統(tǒng)計學(xué)分析26-27
• 第3章 實驗結(jié)果27-32
• 3.1 細胞轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察27
• 3.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡27-28
• 3.3 凋亡基因 Bcl-2 mRNA 和 Bax mRNA 表達結(jié)果變化28-29
• 3.4 Bcl-2 和 Bax 凋亡蛋白表達結(jié)果變化29-30
• 3.5 caspase-9 和 caspase-3 活性表達變化30-32
• 第4章 討論32-37
• 4.1 缺血后處理在心肌缺血再灌注損傷中的心肌保護機制32-33
• 4.2 細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的作用33-34
• 4.3 Notch 1 信號通過抗凋亡途徑在心肌缺血后處理心肌保護的探討34-35
• 4.4 本課題研究的局限性35-36
• 4.5 展望36-37
• 第5章 結(jié)論37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻39-43
• 附圖43-45
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果45-46
• 綜述46-53
• 參考文獻51-53

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