本文關(guān)鍵詞：成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-catenin對(duì)小鼠骨量和骨生長(zhǎng)的調(diào)控作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景和目的： 骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨的顯微結(jié)構(gòu)受損、骨脆性增加，從而導(dǎo)致骨折危險(xiǎn)性升高為特征的疾病，其發(fā)病率隨年齡增加而升高，嚴(yán)重威脅人類健康，其防治對(duì)提高人民生活質(zhì)量和減輕社會(huì)及家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)意義重大。目前，治療骨質(zhì)疏松的常用藥物有雙磷酸鹽、降鈣素、甲狀旁腺素等。各種藥物均顯示了一定的療效，但容易引起臟器功能障礙和繼發(fā)性骨形成減少等副作用[1]。 Wnt/β-catenin信號(hào)通路被證實(shí)在調(diào)控骨量中具有重要作用，，新近發(fā)現(xiàn)，針對(duì)這個(gè)通路研制出的藥物比其他藥物具有增加骨量更明顯的優(yōu)點(diǎn)，顯示了良好的臨床應(yīng)用前景。但其安全性能尚未得到充分證實(shí)，其作用機(jī)制尚存在很多爭(zhēng)議[2]。骨形成和骨吸收二者之間的平衡決定骨的總量：成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)，增加骨量；而破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收，兩者協(xié)同作用調(diào)控骨量。目前大量的研究證實(shí)Wnt/-catenin信號(hào)通路在調(diào)控骨量中具有重要作用：條件敲除β-catenin或Wnt輔受體Lrp6/Lrp5后，小鼠骨量明顯下降；相反，在成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-Catentin可顯著增加骨量。但激活Wnt/β-Catentin信號(hào)通路活增加骨量的機(jī)制尚不明了，對(duì)成骨和破骨的作用效應(yīng)尚存很大的爭(zhēng)議：Holmen和Kramer等人認(rèn)為β-catentin主要通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞數(shù)量和功能調(diào)控骨量，而對(duì)成骨形成沒有影響[3,4]；Cawthorn和Riddle等人認(rèn)為Wnt/β-Catentin主要通過促進(jìn)骨形成增加骨量，對(duì)骨吸收沒有明顯影響[5,6]；而Chen等人證實(shí)β-Catentin同時(shí)通過調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收來(lái)控制骨量[7]。 本研究中，我們以Catnb+/lox(exon3)小鼠和3.2kb pro-collagen I Cre-ERTM小鼠雜交，通過在出生后不同時(shí)期注射他莫昔芬（Tamoxifen，TM）在成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-catenin，觀察不同時(shí)期激活β-catenin后對(duì)小鼠骨量和骨生長(zhǎng)的影響，并初步探討其機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 第一部分：成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-catenin對(duì)小鼠骨量的調(diào)控作用及機(jī)制 將Catnb+/lox(exon3)小鼠和3.2kb pro-collagen I Cre-ERTM小鼠雜交，基因型鑒定篩選CA-β-catenin小鼠作為實(shí)驗(yàn)鼠，而同窩野生組小鼠作為對(duì)照小鼠。在出生后第3日，2、4、5、7月等時(shí)相點(diǎn)注射TM，持續(xù)1月，以持續(xù)激活β-catenin。 1．觀察小鼠外形，測(cè)量小鼠身長(zhǎng)等大體指標(biāo)； 2．X線片和Micro-CT檢測(cè)小鼠出生后不同時(shí)期腰椎、脛骨骨密度、骨量和骨組織結(jié)構(gòu)的變化； 3．HE染色和Safranin O染色觀察小鼠脊椎和長(zhǎng)骨顯微形態(tài)學(xué)變化； 4．TRAP染色破骨細(xì)胞數(shù)量； 5．免疫組織化學(xué)染色觀察成骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞、骨形成、骨吸收等相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化情況,包括骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein, BSP)，Runx2轉(zhuǎn)錄因子（runt-related transcription factor2，Runx2），組織非特異性堿性磷酸酶（nonspecificalkaline phosphatase，TNAP）； 6．定量PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞、骨形成、骨吸收等相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化情況，包括TNAP，Runx2，BSP，抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate ResistantAcidPhosphatase，TRAP），核因子κB受體活化因子配體（Receptor Activator for NuclearFactor-κ B Ligand，RANKL）：骨保護(hù)蛋白（osteoprotegerin，OPG）比值； 7．ELISA檢測(cè)骨形成和骨吸收相關(guān)標(biāo)記物，包括Ⅰ型膠原蛋白氨基端前膠原肽（N-terminal peptide of type Ⅰ procollagen， PINP），骨鈣素（osteocalcin，OC），Ⅰ型膠原交聯(lián)c端肽（C-terminal telopeptide of type I collagen，CTX-I）和抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase5b，TRAcP5b）。 第二部分：成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-catenin對(duì)小鼠骨生長(zhǎng)的影響及可能機(jī)制 1．小鼠模型同上; 2．X線片檢測(cè)小鼠出生后不同時(shí)期小鼠身長(zhǎng)的變化; 3. HE染色和Safranin O染色觀察小鼠脊椎和長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板變化情況; 4．收集小鼠血清，測(cè)量血磷、血鈣等的水平; 5．免疫組織化學(xué)檢測(cè)骨生長(zhǎng)相關(guān)因子FGF23（Fibroblast growth factor23，F(xiàn)GF23）等的變化情況; 6．TUNEL法檢測(cè)椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞凋亡。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．從早期（3天）和晚期（2、4、5、7月）持續(xù)激活β-catenin均可增加松質(zhì)骨骨量。Micro-CT顯示，早期激活時(shí)，小鼠脊椎松質(zhì)骨骨量增加可達(dá)300%，但增加的骨量靠近生長(zhǎng)板一側(cè)；而從2、4、5、7月開始激活，小鼠松質(zhì)骨骨量增加也可達(dá)到180—200%，增加的骨量分布整個(gè)椎體; 2．從早期（3天）和晚期（2、4、5、7月）持續(xù)激活β-catenin后成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物RUNX2、BSP表達(dá)上調(diào)，骨形成標(biāo)記物TNAP表達(dá)增加；同時(shí)，破骨細(xì)胞標(biāo)記物RANKL、TRAP表達(dá)下調(diào)。ELISA提示血清PINP、OC濃度升高，CTX-I、TRAcP5b濃度降低。這些共同提示骨形成增加，骨吸收減少; 3．早期開始激活β-catenin雖然可以增加骨量，但小鼠發(fā)育受到影響，表現(xiàn)為體型變小、長(zhǎng)骨和椎體變短。HE染色和Safranin O染色顯示小鼠生長(zhǎng)板變長(zhǎng)，尤其是肥大層細(xì)胞明顯增多，凋亡減少。而晚期激活β-catenin后骨生長(zhǎng)未受明顯影響; 4．早期持續(xù)激活β-catenin，小鼠血磷水平降低，血鈣水平無(wú)明顯變化，F(xiàn)GF23表達(dá)上調(diào)，這可能是小鼠骨生長(zhǎng)受阻的原因。晚期血磷水平降低，血鈣水平和FGF23表達(dá)未見差異。 結(jié)論： 從早期（3天）和晚期（2、4、5、7月）持續(xù)激活β-catenin均可增加松質(zhì)骨骨量。骨形成增加和骨吸收減少共同作用引起骨量增加。但在早期激活后會(huì)導(dǎo)致骨生長(zhǎng)受阻，其可能機(jī)制是低血磷和FGF23的表達(dá)上調(diào)阻礙了生長(zhǎng)板發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：Wnt/β-catenin通路 骨量 骨生長(zhǎng)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R336
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• Abstract6-10
• 中文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一章 成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-catenin 對(duì)小鼠骨量的調(diào)控作用及機(jī)制15-37
• 1.1 引言15
• 1.2 材料與方法15-22
• 1.3 結(jié)果22-34
• 1.4 討論34-37
• 第二章 成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-catenin 對(duì)小鼠骨生長(zhǎng)的影響及可能機(jī)制37-46
• 2.1 引言37
• 2.2 材料與方法37-39
• 2.3 結(jié)果39-44
• 2.4 討論44-46
• 全文結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 文獻(xiàn)綜述 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路對(duì)骨量的影響50-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

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本文編號(hào)：1041007