本文關(guān)鍵詞：白血病小鼠微移植模型建立及其相關(guān)機制初步研究

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【摘要】：目的建立白血病小鼠H-2全不相合微移植模型并進行鑒定，通過此模型驗證微移植具有促造血、抗白血病等作用，同時避免移植物抗宿主病，并初步探討與上述作用相關(guān)的機制。 內(nèi)容1、建立小鼠白血病模型根據(jù)本研究室已成熟的方法及參考相關(guān)文獻建立小鼠急性粒單核細胞（M4）白血病模型并鑒定；2、白血病小鼠化療方案的優(yōu)化采用不同的MA(米托蒽醌+阿糖胞苷)化療方案，通過比較早期死亡率、骨髓抑制等指標來選擇微移植中的化療方案；3、回輸供體動員的脾細胞量的優(yōu)化及微移植模型的鑒定回輸不同的供體動員后脾細胞，通過比較早期死亡率、促白細胞恢復及相同時間點白血病負荷等，選擇微移植中合適的供體細胞量。微移植模型建立后在供體嵌合及GVHD兩方面對模型進行鑒定；4、微移植促造血、抗白血病效應(yīng)同時避免GVHD機制的初步研究通過觀察白血病小鼠微移植后一般情況、供體嵌合體變化規(guī)律、造血恢復情況、白血病負荷變化、細胞因子及骨髓、肝、脾及腸道病理變化等初步研究探討微移植發(fā)揮上述作用的相關(guān)機制。 方法受鼠為雌性BALB/c小鼠(H2Kd/d)，供鼠為雄性C57小鼠(H2Kb/b)，供受體H-2全不相合。首先建立小鼠白血病模型，雌性BALB/c小鼠隨機分成2組(n=10)，白血病模型組和正常對照組,白血病模型組小鼠經(jīng)尾靜脈接種約1×106個WEHI-3細胞（小鼠急性髓系白血病M4細胞株），正常對照組接種等量生理鹽水。從外周血涂片、骨髓形態(tài)學、免疫組化、免疫表型及病理組織學等方面診斷發(fā)病情況，并記錄死亡情況。其次進行MA化療方案的優(yōu)化（n=8），受鼠接種1×106/個WEHI-3細胞后，隨機分成3組(米托蒽醌2mg/kg×1d+阿糖胞苷200mg/kg×3d、米托蒽醌4mg/kg×1d+阿糖胞苷200mg/kg×3d、米托蒽醌8mg/kg×1d+阿糖胞苷200mg/kg×3d)，通過早期死亡率及骨髓抑制情況選取合適化療方案。然后進行回輸供體細胞量的優(yōu)化，供鼠自微移植-5天開始接受皮下rhG-CSF（100μg/kg）的動員，q12h×5d,末次動員12小時后進行脾單個核細胞的提取。接種白血病細胞的受鼠化療后給予回輸不同數(shù)量的經(jīng)動員后的供體脾單個核細胞，細胞量分別為（3、6、12）×107個（n=12），比較各組早期死亡率、促白細胞恢復及白血病負荷情況，來選擇合適的供體細胞量。微移植模型建立后從供體嵌合率、GVHD發(fā)生情況量方面對模型進行鑒定。最后比較微移植組和單純化療對照組的早期死亡率、促造血恢復、相同時間點的白血病負荷、生存情況等，以驗證微移植的療效。對細胞因子、供體嵌合等進行檢測，，初步研究微移植發(fā)揮相關(guān)作用的機制。 結(jié)果小鼠白血病模型建立：白血病模型組小鼠在2周之內(nèi)全部發(fā)病,骨髓中原始細胞比例占NEC（非紅有核計數(shù)）的30%以上，生存期為17-35天。接種后第3周，白血病模型組小鼠外周血白細胞最高可達85.09×109/L，與正常對照組小鼠差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。骨髓細胞免疫組化提示POX（+）、CE（+）、NSE（+）、NaF（-）。發(fā)病小鼠各器官中可見大量白血病細胞浸潤。結(jié)果與本實驗室及相關(guān)文獻結(jié)果一致，說明此白血病模型較為穩(wěn)定�；煼桨竷�(yōu)化：3組化療方案(①M2mg/kg×1d+A200mg/kg×3d、②M4mg/kg×1d+A200mg/kg×3d、③M8mg/kg×1d+A200mg/kg×3d)早期死亡率分別為0、25%、100%，①②死亡差異無統(tǒng)計學意義（P0.05），①②與③死亡率差異顯著（P0.01）；在骨髓抑制方面，②比①�；煹�1-4天白細胞低，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05），綜合死亡率和骨髓抑制結(jié)果選�、贛A(M4mg/kg×1d+A200mg/kg×3d)作為化療方案�；剌敿毎窟x擇方面：早期死亡率，化療對照組為25%，（3、6、12）×107組分別為16.67%、8.33%、8.33%，四組之間差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；白細胞恢復情況，（3、6）×107組明顯優(yōu)于12×107組，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；白血病負荷檢測結(jié)果顯示(3、6、12)×107組較化療對照組負荷低，有顯著性差異（P0.01），(6、12)×107較3×107組低，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），6×107與12×107差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。綜合早期死亡率、促白細胞恢復和白血病負荷結(jié)果選取6×107作為回輸?shù)墓w細胞量，后續(xù)的實驗以此細胞量為標準。微移植模型鑒定：微移植后供體成分可在回輸供體細胞后2周之內(nèi)檢測到，是以微嵌合形式存在。通過與單純化療組小鼠比較，微移植組小鼠在臨床表現(xiàn)及病理方面均未發(fā)現(xiàn)明顯GVHD證據(jù)。微移植促造血作用、抗白血病效應(yīng)同時避免GVHD觀察及機制初步研究：微移植組早期死亡率明顯降低，白細胞恢復情況較化療組有優(yōu)勢，發(fā)病時間較化療組延遲2周左右。微移植后供體微嵌合在回輸后2周之內(nèi)可檢測到；細胞因子檢測發(fā)現(xiàn)微移植后2周特別是1周之內(nèi)細胞因子升高最為明顯，其中IL-2、IL-6、TNF、IFN在微移植組和化療對照組之間差異最明顯。 結(jié)論成功建立了小鼠白血病模型，選取了（M4mg/kg×1d+A200mg/kg×3d）作為微移植化療方案，并選取6×107作為回輸?shù)墓w細胞量，從供體嵌合和GVHD方面對微移植模型進行了鑒定，成功建立了微移植模型。通過白血病小鼠微移植模型建立及組織病理學和細胞因子等相關(guān)指標的檢測，推測微移植促造血作用可能與輸注大量異基因造血細胞對受者造血組織的保護作用以及對白血病細胞快速清除并促進體內(nèi)參與造血的細胞因子如IL-6等濃度升高有關(guān)，微移植發(fā)揮抗白血病效應(yīng)可能與供體微嵌合狀態(tài)、微移植后細胞因子如IL-2、IFN、TNF升高等變化有關(guān)。微移植避免GVHD發(fā)生可能與微移植理念有關(guān)。該白血病小鼠H-2全不相合微移植模型的建立及相關(guān)研究為微移植動物及臨床研究提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：WEHI-3細胞 白血病小鼠 微移植 H-2全不相合 微嵌合 移植物抗白血病效應(yīng) 移植物抗宿主病
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R733.7;R-332
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 第一部分 小鼠白血病模型的建立及鑒定15-21
• 材料方法15-17
• 結(jié)果17-19
• 討論19-20
• 小結(jié)20-21
• 第二部分 化療方案的優(yōu)化21-24
• 材料方法21-22
• 結(jié)果22-23
• 討論23
• 小結(jié)23-24
• 第三部分 回輸供體細胞量的優(yōu)化及微移植模型的鑒定24-34
• 材料方法24-28
• 結(jié)果28-32
• 討論32-33
• 小結(jié)33-34
• 第四部分 微移植發(fā)揮抗白血病效應(yīng)同時避免移植物抗宿主病相關(guān)機制的初步研究34-44
• 材料方法35-36
• 結(jié)果36-40
• 討論40-42
• 小結(jié)42-44
• 參考文獻44-49
• 綜述 移植物抗白血病效應(yīng)和移植物抗宿主病分離策略的研究進展49-58
• 參考文獻53-58
• 論著 白血病小鼠 H2 全不相合微移植模型的建立及鑒定58-68
• 參考文獻66-68
• 個人簡歷68-69
• 致謝69

【參考文獻】

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1 陳龍邦;;抗腫瘤化療與抗腫瘤免疫[J];醫(yī)學研究生學報;2008年02期

本文編號：1040150