本文關(guān)鍵詞：GeXP多基因遺傳表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)人TCRVα和TCRVβ鏈CDR3譜型及長(zhǎng)度的方法建立以及初步應(yīng)用

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【摘要】：目的：利用GeXP多重基因表達(dá)系統(tǒng)建立兩種多重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mRT-PCR)的方法，分別檢測(cè)TCR Vα和TCR Vβ鏈的CDR3譜型及長(zhǎng)度，用于分析T細(xì)胞克隆增殖情況。分析肺癌患者胸水中TIL的TCR Vα和TCR Vβ家族的克隆增殖情況，并克隆具有寡克隆或單克隆增生現(xiàn)象的TCR Vα和TCR Vβ基因構(gòu)建重組嵌合型腺病毒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ。研究此TCR Vα和TCRVβ基因修飾的PBMC對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，確定是否為肺癌相關(guān)的TCR基因，為以后發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性TCR基因并利用特異性TCR基因修飾T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼免疫治療打下基礎(chǔ)。 方法： 一、收集正常人外周血，分離出單核細(xì)胞，提取總RNA，利用GeXP多重基因表達(dá)系統(tǒng)建立多重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法檢測(cè)人PBMC中22個(gè)TCR Vβ家族的CDR3的譜型和長(zhǎng)度，用于分析亞家族的比例以及克隆增殖情況。 二、收集正常人外周血，分離出單核細(xì)胞，提取總RNA，利用GeXP多重基因表達(dá)系統(tǒng)建立多重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法檢測(cè)人PBMC中32個(gè)TCR Vα亞家族的CDR3的譜型長(zhǎng)度，用于分析亞家族的克隆增殖情況。 三、收集肺癌患者胸水，分離出單核細(xì)胞，提取總RNA，利用上述建立的兩種方法分析肺癌患者胸水中TIL的TCR Vβ家族和TCR Vα家族的克隆增殖情況。 四、提取肺癌患者胸水單核細(xì)胞的總RNA，克隆肺癌患者胸水TIL中呈現(xiàn)寡克隆增殖的的TCR Vβ基因和TCR Vα基因，并構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒 pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ。 五、通過(guò)Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將腺病毒骨架質(zhì)粒與構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，包裝表達(dá)目的基因的重組腺病毒。獲得的初病毒提取病毒基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的基因。用病毒轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞，檢測(cè)目的基因表達(dá)情況。將鑒定正確的重組嵌合型腺病毒進(jìn)行大量擴(kuò)增，過(guò)濾TCID50法測(cè)病毒滴度。用重組腺病毒感染PBMC，36小時(shí)后分別作用于肺癌細(xì)胞株NCI-H1299（HLA-A2+）、NCI-H1299（HLA-A2-）、肝癌細(xì)胞株HepG2（HLA-A2+），7402（HLA-A2-）。用MTT法在12h、24h、36h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)殺傷效果。 結(jié)果：成功地利用GeXP多重基因表達(dá)系統(tǒng)建立兩種多重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mRT-PCR)的方法，檢測(cè)出22個(gè)TCR Vβ家族以及32個(gè)TCR Vα家族CDR3長(zhǎng)度以及譜型情況。GeXP檢測(cè)5例肺癌患者胸水中TIL的TCR Vβ家族和TCR Vα家族的CDR3譜型，結(jié)果顯示除P2病人所有家族均為多克隆外，其余四例患者均出現(xiàn)單克隆性或寡克隆性增生的現(xiàn)象，通過(guò)測(cè)序，P1寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD2-TRBJ2S1)和TRAV26(TRAV26-TRAJ20)；P3寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD1-TRBJ2S1)和TRAV17(TRAV17-TRAJ20)；P4寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD1-TRBJ2S1)和TRAV7(TRAV7-TRAJ5)；P5單克隆增生的TRBV17(TRBV17-TRBD2S2-TRBJ2S1)和TRAV5(TRAV5-TRAJ27)。從P5患者中成功克隆獲得TCR Vα5和TCR Vβ17基因，并正確構(gòu)建了重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-TCR Vα5-IRES-TCR Vβ17。通過(guò)Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，利用腺病毒包裝細(xì)胞包裝重組腺病毒。提取重組腺病毒基因組，PCR擴(kuò)增得到Fiber35和TCR Vβ17基因，說(shuō)明目的基因已經(jīng)整合到病毒基因組中。病毒感染PBMC后流式檢測(cè)，目的基因得到有效表達(dá)。用重組腺病毒感染PBMC后，進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)TCRVα5-TCRVβ17基因轉(zhuǎn)染的PBMC的抗腫瘤能力為NCI-H1299(HLA-A2+)HepG2(HLA-A2+)NCI-H1299(HLA-A2-)7402(HLA-A2+)。 結(jié)論：GeXP檢測(cè)五例肺癌患者TIL，均出現(xiàn)了TCR Vα和TCR Vβ家族的寡克隆或單克隆增生的現(xiàn)象（除P2），推測(cè)可能是由于在腫瘤局部的特異性抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的。從肺癌患者胸水中克隆獲得TRAV5（TRAV5-TRAJ27）和TRBV17(TRBV17-TRBD2S2-TRBJ2S1)基因，并成功構(gòu)建了重組腺病毒載體。殺傷實(shí)驗(yàn)顯示重組TCR腺病毒感染的PBMC對(duì)兩株肺腺癌細(xì)胞株均具有殺傷效果，但對(duì)HLA-A2+肺腺癌細(xì)胞的殺傷效率明顯高于HLA-A2-肺腺癌細(xì)胞，并且對(duì)非肺癌細(xì)胞7402細(xì)胞沒(méi)有殺傷效果，，說(shuō)明該寡克隆增生的TCR Vα和TCR Vβ家族是由肺癌引起的特異性增殖T細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：GeXP TCR 重組腺病毒 Vα5 Vβ17
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-19
• 第一部分 GeXP 多重基因分析系統(tǒng)檢測(cè)人 TRBV 亞家族 CDR3 譜系方法的建立19-42
• 引言19
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本19
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑19-20
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法21-32
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的收集21
• 1.2.2 單核細(xì)胞的分離21
• 1.2.3 GeXP 多重基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)人淋巴細(xì)胞 TCRVβ亞家族方法建立21-25
• 1.2.4 RT-mPCR 條件的優(yōu)化25-27
• 1.2.5 GeXP 檢測(cè)系統(tǒng)的檢驗(yàn)27-32
• 1.3 結(jié)果32-40
• 1.3.1 管家基因 GAPDH RT 引物的優(yōu)化32-34
• 1.3.2 內(nèi)參基因 KanR 加入模版濃度的優(yōu)化34-35
• 1.3.3 陽(yáng)性質(zhì)粒模版的構(gòu)建35-36
• 1.3.4 單引物多模板擴(kuò)增特異性36-37
• 1.3.5 多引物多模板擴(kuò)增的特異性37-38
• 1.3.6 健康人 PBMC TCR Vβ亞家族 GeXP 檢測(cè)38-40
• 1.4 小結(jié)40-42
• 第二部分 GeXP 多重基因分析系統(tǒng)檢測(cè)人 TRAV 亞家族 CDR3 譜系的方法建立42-52
• 前言42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料42
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本42
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑42
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器42
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法42-47
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的收集42-43
• 2.2.2 單核細(xì)胞的分離43
• 2.2.3 GeXP 多重基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)人淋巴細(xì)胞 TCRVα家族 CDR3 譜系的方法建立43-46
• 2.2.4 GeXP 檢測(cè)系統(tǒng)的檢驗(yàn)46-47
• 2.3 結(jié)果47-51
• 2.3.1 單引物擴(kuò)增的特異性47-48
• 2.3.2 健康人 PBMC TCR Vα亞家族 GeXP 檢測(cè)48-51
• 2.4 小結(jié)51-52
• 第三部分 肺癌患者胸水 TIL 中 TCR 家族 CDR3 譜型的初步分析52-58
• 前言52
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料52-53
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本52-53
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑53
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器53
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法53-55
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的收集53
• 3.2.2 RNA 的提取53
• 3.2.3 第一鏈 cDNA 的合成53
• 3.2.4 多重 PCR 分別擴(kuò)增病人胸水中 TIL 中 TCR Vα和 TCR Vβ的 CDR3 片段53-54
• 3.2.5 GeXP 上機(jī)檢測(cè)54
• 3.2.6 寡克隆增殖亞家族 CDR3 片段序列分析54-55
• 3.3 結(jié)果55-57
• 3.3.1 肺癌患者胸水中 TIL 中 TCR Vα和 TCR Vβ的 CDR3 譜型 GeXP 分析55-56
• 3.3.2 5 例肺癌病人胸水 TIL 中 TCR Vα和 TCR Vβ家族寡克隆或單克隆測(cè)序56-57
• 3.4 小結(jié)57-58
• 第四部分 pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 雙表達(dá)載體的構(gòu)建58-70
• 引言58
• 4.1 材料58-59
• 4.1.1. 質(zhì)粒、菌株、試劑58-59
• 4.1.2 儀器59
• 4.2 方法59-65
• 4.2.1 TCR Vα5 、TCR Vβ17 基因的獲取59-61
• 4.2.2 膠回收 PCR 產(chǎn)物連接 T 載體61
• 4.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取61-62
• 4.2.4 構(gòu)建 pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 雙表達(dá)穿梭載體62-65
• 4.3 結(jié)果65-69
• 4.3.1 獲取 TCR Vα5 、TCR Vβ17 基因65-66
• 4.3.2 TCR Vα5 、TCR Vβ17 基因連接 T 載體測(cè)序結(jié)果66
• 4.3.3 構(gòu)建 pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 雙表達(dá)穿梭載體結(jié)果66-69
• 4.5 小結(jié)69-70
• 第五部分 重組嵌合型腺病毒 Ad5/F35 的包裝、鑒定以及滴度測(cè)定和 TCR Vβ17、TCR Vα5 重組腺病毒的抗瘤譜70-78
• 引言70
• 5.1 材料70
• 5.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和試劑70
• 5.1.2 儀器70
• 5.2 方法70-73
• 5.2.1 重組嵌合型腺病毒 Ad5/F35，pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 的包裝70-71
• 5.2.2 重組嵌合型腺病毒鑒定71-73
• 5.2.3 重組腺病毒抗瘤譜73
• 5.3 結(jié)果73-77
• 5.3.1 HEK-293 細(xì)胞包裝腺病毒73-74
• 5.3.2 重組嵌合型腺病毒 Ad5/F35. TCR Vβ17 的 PCR 鑒定74
• 5.3.3 重組嵌合型腺病毒 Ad5/F35. pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 流式鑒定74-75
• 5.3.4 重組嵌合型腺病毒 Ad5/F35 pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 擴(kuò)大培養(yǎng)75
• 5.3.5 腫瘤細(xì)胞株中 HLA 分型75-76
• 5.3.6 MTT 比色法檢基因 TCR Vα5、Vβ17 重組腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果76-77
• 5.4 小結(jié)77-78
• 討論78-82
• 參考文獻(xiàn)82-89
• 附錄一 英文縮略詞表89-90
• 附錄二 質(zhì)粒圖譜90-92
• 附錄三 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文92-93
• 致謝93

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 ;Analysis of the CDR3 Length Repertoire and the Diversity of TCRα Chain in Human Peripheral Blood T Lymphocytes[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年03期

2 周昕熙,李錦添,吳一龍,王思愚,楊學(xué)寧,陳詩(shī)萍;非小細(xì)胞肺癌患者T細(xì)胞受體Vβ表達(dá)和克隆性研究[J];中國(guó)肺癌雜志;2003年02期

3 李惠芳,萬(wàn)遠(yuǎn)廉,劉玉村,湯堅(jiān)強(qiáng),吳濤,張英,朱平;直腸癌腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞受體基因譜型特征[J];中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志;2003年06期

本文編號(hào)：1029537