本文關(guān)鍵詞：利用噬菌體展示技術(shù)制備全人抗DR5 scFv抗體

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【摘要】：背景DR5是腫瘤壞死因子TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)的配體（TNF-relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL）的一個(gè)受體，通過它，TRAIL能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)室利用DR5抗原制備出能分泌抗DR5的雜交瘤細(xì)胞。該抗體為鼠單克隆抗體，但存在一些不足之處，妨限制了其在臨床上的應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)制備出全人抗體，不僅克服了鼠源性的弊端，鼠單抗特異性強(qiáng)、均一性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)也被保留了下來。其中，，全人抗體和人源化抗體的制備技術(shù)包括了以下三個(gè)方面：嵌合抗體、CDR移植的抗體和展示技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備的抗體，其中以噬菌體展示技術(shù)可以制備全人抗體，從根本上克服了HAMA（human anti-mouse antibody）反應(yīng)，因此，噬菌體抗體庫技術(shù)屬于最理想的制備全人抗體人方式。 目的通過利用噬菌體展示技術(shù)來建立天然噬菌體抗體庫，并從中篩選、制備全人源化抗體。 方法應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從人外周血淋巴細(xì)胞中獲取人抗體可變區(qū)基因VH、VL，用重疊延伸PCR技術(shù)把連接肽基因（Gly_4Ser）3與VH和VL連接成單鏈抗體scFv，利用SfiI和NotⅠ酶切位點(diǎn)，將scFV基因連接入表達(dá)載體pcantab-5E中，電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coilX-Blue中，利用噬菌體感染，建立初級噬菌體抗體庫。利用菌液PCR來鑒定所建立噬菌體抗體庫的插入率，挑取陽性克隆送北京金唯智生物技術(shù)公司測序，并經(jīng)NCBI-Blast-Ig-Blast，來鑒定噬菌體抗體庫的多樣性。利用固相篩選對所建立的初級噬菌體抗體庫進(jìn)行四輪富集濃縮，通過ELISA篩選出抗DR5的scFV段陽性克隆。 結(jié)果成功的構(gòu)建了庫容量為1.01×107的天然噬菌體抗體庫，經(jīng)測序比對后多樣性良好，并從中篩選出一株表達(dá)頻率較高的克隆，和4株與抗TNF-α抗體高度同源的克隆。 結(jié)論成功的篩選出多株全人抗DR5抗體scFv，為抗體蛋白的獲得打下了良好地基礎(chǔ)。并建立起了一個(gè)天然全人抗體庫的技術(shù)平臺，為以后篩選針對各種毒素、病毒、病原菌等的相關(guān)抗原的抗體和獲得特異性人源化抗體類藥物奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：噬菌體展示技術(shù) 天然噬菌體抗體庫 全人抗體 DR5
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 縮略詞表8-11
• 前言11-15
• 1.材料與方法15-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑15-16
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器16-17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-33
• 1.2.1 引物設(shè)計(jì)17-21
• 1.2.2 人外周血中淋巴細(xì)胞的分離21
• 1.2.3 總 RNA 的提取21-22
• 1.2.4 cDNA 的合成22
• 1.2.5 人抗體可變區(qū) VH、VL 基因的巢式 PCR 擴(kuò)增22-24
• 1.2.6 目的基因片段的膠回收24-25
• 1.2.7 重疊延伸 PCR 進(jìn)行人單鏈 scFv 片段的組裝25-26
• 1.2.8 目的片段 scFV 與載體 pcantab-5E 的雙酶切26
• 1.2.9 scFv 與 pcantab-5E 的連接26-27
• 1.2.10 XL-Blue 電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備27
• 1.2.11 輔助噬菌體 VCSM13 的擴(kuò)增27
• 1.2.12 噬菌體滴度的測定27-28
• 1.2.13 電轉(zhuǎn)化建立初級噬菌體抗體庫28-29
• 1.2.14 初級噬菌體庫的插入率、多樣性分析29
• 1.2.15 BCA 法測定 DR5 抗原濃度29-30
• 1.2.16 第一輪富集篩選30-31
• 1.2.17 制備帶篩選克隆31
• 1.2.18 ELISA 篩選陽性克隆31-33
• 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-41
• 2.1 VH、VL 基因片段的擴(kuò)增33-34
• 2.2 scFV 的擴(kuò)增及純化34-35
• 2.3 噬菌體抗體庫容量的測定35
• 2.4 噬粒目的片段插入率的測定35-36
• 2.5 噬菌體抗體庫多樣性的測定36-37
• 2.6 BCA 測定蛋白濃度37
• 2.7 噬菌體文庫的淘洗37-38
• 2.8 抗 DR5 陽性克隆的 ELISA 篩選38-41
• 3.討論41-45
• 結(jié)論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 文獻(xiàn)綜述51-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 致謝63-64

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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本文編號：1019368