本文關(guān)鍵詞：來源于Vero細(xì)胞的乙型腦炎滅活疫苗純化工藝研究

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【摘要】：研究背景：國內(nèi)外乙腦疫苗臨床結(jié)果表明，人體對乙腦抗原本身（滅活的乙腦病毒）耐受性良好，乙腦疫苗免疫后人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)輕微。臨床研究和臨床使用過程中出現(xiàn)的少數(shù)嚴(yán)重不良反應(yīng)或不良事件，已證明與抗原本身無關(guān)，而抗原外的其他成分才是免疫人群產(chǎn)生不良反應(yīng)的主要原因。這些成分包括：病毒培養(yǎng)用動物細(xì)胞的殘留蛋白質(zhì)和殘留DNA；培養(yǎng)基殘留如小牛血清；滅活劑殘留（如甲醛）；制劑添加的賦形劑（如明膠）、防腐劑（如硫柳汞）等。因此，對乙腦滅活疫苗而言，盡可能提高抗原純度，避免在制劑中添加不合適的賦形劑、保護(hù)劑和防腐劑，制品的安全性將有可能得到進(jìn)一步提高。 研究目的：國內(nèi)外現(xiàn)有的乙腦疫苗純化工藝，普遍采用區(qū)帶離心技術(shù)路線或多步凝膠過濾技術(shù)路線。存在的最大問題是有害物質(zhì)殘留量過高，從而導(dǎo)致疫苗產(chǎn)品存在安全性隱患。為此，本課題對乙腦疫苗的純化工藝進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,以期提高疫苗成品的純度，減少接種副反應(yīng)的發(fā)生。 研究方法：（1）滅活工藝研究：比較甲醛與β-丙內(nèi)酯兩種滅活劑對乙腦病毒的滅活效果；（2）濃縮工藝研究：研究不同孔徑超濾膜包和不同濃縮倍數(shù)對濃縮效果的影響；（3）研究Sepharose4FF和Sephacryl S-300兩種分子篩填料對乙腦病毒的純化效果；（4）研究離子交換層析對乙腦病毒的純化效果；（5）用優(yōu)化得到的工藝路線進(jìn)行了三批小試樣品和三批中試樣品的純化。 研究結(jié)果：（1）β-丙內(nèi)酯作為滅活劑滅活乙腦病毒有良好的回收率及更低的生產(chǎn)成本；（2）使用300K孔徑的膜包濃縮20倍的濃縮工藝參數(shù)可以得到較高的抗原回收率及降低后期純化的處理體積；（3）Sepharose4FF層析可以得到純度較高的樣品，，而SephacrylS-300層析樣品的抗原回收率更高，在兩種填料單步純化均未達(dá)《藥典》相關(guān)要求情況下，優(yōu)先選擇更高回收率的Sephacryl S-300作為第一步精純；（4）經(jīng)過離子交換層析后，宿主DNA殘留小于10pg/劑，Vero細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量、牛血清白蛋白殘留量均低于2010版藥典標(biāo)準(zhǔn)10倍以上；（5）三批小試和三批中試樣品得到的純化后原液均穩(wěn)定達(dá)標(biāo)。 研究結(jié)論：在原有工藝中增加離子交換層析進(jìn)行進(jìn)一步精純，使抗原純度得到大幅度提升，不僅殘余DNA可達(dá)10pg/劑以下，Vero細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量、牛血清白蛋白殘留量均低于2010版藥典標(biāo)準(zhǔn)10倍以上，也顯著低于國內(nèi)所有同類產(chǎn)品，保持了疫苗良好的免疫原性并提高了疫苗的安全性。由于乙腦病毒疫苗接種對象為少年兒童，高質(zhì)量的產(chǎn)品必將大大降低接種人群的副反應(yīng)和概率，成為父母和醫(yī)護(hù)人員所歡迎的產(chǎn)品，能產(chǎn)生較高的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
【關(guān)鍵詞】：乙型腦炎 滅活病毒 疫苗 滅活 純化
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目錄9-12
• 第一章 緒論12-20
• 1.1 乙型腦炎病及乙型腦炎病毒12-13
• 1.1.1 乙型腦炎病的流行及其危害12
• 1.1.2 乙型腦炎病毒的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)12-13
• 1.1.3 乙型腦炎流行病的預(yù)防和控制措施13
• 1.2 國內(nèi)外乙腦疫苗的研發(fā)和使用情況13-17
• 1.2.1 國外乙腦疫苗的研發(fā)、生產(chǎn)和使用情況13-14
• 1.2.2 國內(nèi)乙腦疫苗研發(fā)、生產(chǎn)和使用情況14-16
• 1.2.3 國內(nèi)外現(xiàn)有疫苗存在的問題16-17
• 1.2.4 國內(nèi)外乙腦疫苗的技術(shù)發(fā)展趨勢17
• 1.3 本課題的立題背景17-20
• 1.3.1 現(xiàn)有的乙腦疫苗純化工藝路線17-18
• 1.3.1.1 區(qū)帶離心(density gradient centrifugation)17-18
• 1.3.1.2 凝膠過濾柱層析(gel filtration chromsomegraphy)18
• 1.3.2 現(xiàn)有乙腦疫苗純化工藝路線存在的問題18-19
• 1.3.3 本課題的研究目的19-20
• 第二章 材料與方法20-31
• 2.1 儀器與設(shè)備20
• 2.2 材料20-22
• 2.3 方法22-31
• 2.3.1 制備方法22-23
• 2.3.1.1 培養(yǎng)原液的制備22
• 2.3.1.2 磷酸緩沖液的制備22
• 2.3.1.3 各種蔗糖濃度的制備22-23
• 2.3.1.4 鈣鎂鹽水的制備23
• 2.3.1.5 補(bǔ)體的制備23
• 2.3.2 病毒滴度檢測23-24
• 2.3.3 病毒滅活驗證24
• 2.3.4 蛋白含量檢測（Lowry法）24-25
• 2.3.5 抗原量檢測25-26
• 2.3.6 宿主蛋白殘留檢測26
• 2.3.7 宿主DNA殘留檢測26-29
• 2.3.8 牛血清蛋白殘留檢測29
• 2.3.9 疫苗效力檢測29-31
• 第三章 研究內(nèi)容與結(jié)果31-53
• 3.1 抗原前處理工藝研究31-37
• 3.1.1 培養(yǎng)原液的滅活工藝研究31-36
• 3.1.1.1 甲醛滅活溫度及時間的選擇31-33
• 3.1.1.2 β 丙內(nèi)酯滅活工藝研究33-36
• 3.1.1.3 兩種滅活劑滅活效果比較36
• 3.1.2 培養(yǎng)原液濃縮工藝研究36-37
• 3.1.2.1 超濾膜包孔徑對濃縮效果的影響36-37
• 3.1.2.2 濃縮倍數(shù)對濃縮效果的影響37
• 3.2 抗原精細(xì)純化工藝研究37-53
• 3.2.1 凝膠過濾柱層析純化研究37-43
• 3.2.1.1 樣品上樣量對Sepharose 4FF層析分離效果的影響比較37-40
• 3.2.1.2 樣品上樣量對S300 層析分離效果的影響比較40-42
• 3.2.1.3 兩種層析填料層析效果比較42-43
• 3.2.2 離子交換柱層析純化研究43-45
• 3.2.3 乙腦病毒滅活后抗原EIA值與動物免疫效力之間關(guān)系的研究45
• 3.2.4 小試純化工藝研究45-48
• 3.2.5 中試純化工藝研究48-51
• 3.2.6 與國內(nèi)外同類制品的純化技術(shù)路線比較研究51-53
• 結(jié)論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 致謝58-59
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果59-60
• 附件60

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳品全;周本立;馬文信;李昭毅;朱進(jìn);張建林;翁正一;江秀坤;;SA_(14)-14-2株乙型腦炎活疫苗流行病學(xué)效果觀察[J];中國生物制品學(xué)雜志;1992年03期

2 俞永新;WHO/CVI召開的“疫苗接種控制乙型腦炎”國際會議報道[J];中國生物制品學(xué)雜志;1999年04期

3 ;地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)流行性乙型腦炎滅活疫苗的效果[J];微生物學(xué)報;1976年01期

4 謝東生;中國乙腦疫苗的研制進(jìn)展[J];中國公共衛(wèi)生;1997年01期

5 馬福寶,孫曉冬,應(yīng)穎,丁筱竹,徐文忠,余錄根,李燕婷,趙莉莉,刁連東,蔡光輝,謝廣中;流行性乙型腦炎滅活疫苗免疫接種反應(yīng)前瞻性調(diào)查[J];中國計劃免疫;2000年04期

6 吳炳娟,鄒立秋,常桂英;一起接種流行性乙型腦炎滅活疫苗引起的群體性癔癥反應(yīng)[J];中國計劃免疫;2000年05期

7 閆紹宏,張雙一,吳振華,張連仲,田美成,趙玉英;純化凍干Vero細(xì)胞流行性乙型腦炎滅活疫苗人體接種反應(yīng)及免疫效果觀察[J];中國計劃免疫;2002年01期

8 張雙一;趙玉英;閻紹宏;黃愛義;王琪;詹剛;;純化流行性乙型腦炎滅活疫苗臨床觀察及免疫原性研究[J];中華流行病學(xué)雜志;2006年02期

9 丁志芬,石慧穎,龐成華,常振彥,趙敏,李荊,楊抗抗,劉培生;轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)非洲綠猴腎傳代細(xì)胞生產(chǎn)純化流行性乙型腦炎疫苗的研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;1998年04期

10 程國民;接種流行性乙型腦炎減毒活疫苗后出現(xiàn)血管神經(jīng)性水腫致尺橈神經(jīng)損害1例報告[J];中國計劃免疫;2000年05期

本文編號：1007886