發(fā)布時(shí)間：2017-10-10 19:34

  本文關(guān)鍵詞：快速檢測(cè)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的傳感方法的建立

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【摘要】：環(huán)境、飲水、食品中的致病菌是危害人體健康的重要因素。近年來(lái)，，世界各地不同規(guī)模的食源性致病菌導(dǎo)致的疾病爆發(fā)事件時(shí)有發(fā)生，全球每年因食品和飲用水的細(xì)菌污染導(dǎo)致的死亡有上百萬(wàn)人。主要致病菌有大腸桿菌、副溶血弧菌、李斯特氏菌、金黃葡萄球菌、沙門(mén)氏菌等。食源性致病菌的檢測(cè)對(duì)于食源性疾病預(yù)防與控制起著至關(guān)重要的作用。因此，為了有效控制食品質(zhì)量、保證食品安全、避免突發(fā)性疾病以及最大程度減小社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的不穩(wěn)定因素，建立簡(jiǎn)便、快速、高效和成本低廉的食源性致病菌檢測(cè)手段，成為目前食品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的迫切需求。本文建立了快速檢測(cè)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的電流型和光電型兩種生物傳感器，對(duì)其檢測(cè)性能進(jìn)行了評(píng)估。原理、過(guò)程及結(jié)果概括如下： 1.檢測(cè)銅綠假單胞菌的光電型生物傳感方法的建立：銅綠假單胞菌可以分泌細(xì)胞色素氧化酶，能使細(xì)胞色素C氧化，而氧化型細(xì)胞色素C可以使鹽酸二甲基對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。該顏色反應(yīng)的深淺和銅綠假單胞菌的濃度之間呈明顯的線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)此反應(yīng)原理，設(shè)計(jì)一種便攜型光電型試紙條，在該試紙條上包被鹽酸二甲基對(duì)苯二胺氧化反應(yīng)液，測(cè)試時(shí)將樣品溶液加到試紙條的加樣孔處，用自行研制的光電檢測(cè)儀測(cè)定不同濃度的銅綠假單胞菌對(duì)應(yīng)的反應(yīng)體系光反射率的大小，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并優(yōu)化反應(yīng)條件，從而建立光電型生物傳感方法對(duì)銅綠假單胞菌的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用該方法檢測(cè)銅綠假單胞菌的方程為：Y=1527.35714-133.96429X，相關(guān)系數(shù)為R=-0.99974(p0.01)，檢測(cè)限為103CFU/mL，樣品檢測(cè)時(shí)間低于5分鐘。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化，有望在生產(chǎn)實(shí)踐中得到應(yīng)用。 2.檢測(cè)大腸桿菌的光電型生物傳感方法的建立：用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)使大腸桿菌分泌β-半乳糖苷酶，將黃色的氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)加入到催化好的含有β-半乳糖苷酶的待測(cè)液中，反應(yīng)生成紅色的氯酚紅(CPR)，反應(yīng)顏色變化的深淺和大腸桿菌的濃度呈良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。測(cè)試時(shí)，將該反應(yīng)體系滴入自制的光電型試紙條中用光電型傳感儀檢測(cè)光反射率，反射率的高低與樣品中大腸桿菌的濃度呈反比關(guān)系，由此建立檢測(cè)大腸桿菌的光電型傳感方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用光電傳感方法檢測(cè)大腸桿菌，反應(yīng)體系適宜pH=7.5，酶促反應(yīng)時(shí)間為4h。樣品中細(xì)菌濃度的對(duì)數(shù)與反射光信號(hào)值之間呈現(xiàn)良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，方程為Y=1426.10485-97.23368X，相關(guān)系數(shù)為R=-0.98944(P0.01)，檢測(cè)限可達(dá)104CFU/mL，樣品檢測(cè)時(shí)間低于5分鐘�；陬伾磻�(yīng)的光電傳感方法檢測(cè)大腸桿菌具有快速、簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，為檢測(cè)大腸桿菌提供了新思路，具有良好的進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用前景。 3.檢測(cè)大腸桿菌的電流型生物傳感方法的建立：用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)使大腸桿菌分泌β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶特異性作用于4-(2-吡啶偶氮)-鄰苯三酚(PAPG)，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生4-氨基酚(PAP)，該氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的電流值與樣品中大腸桿菌濃度呈良好的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此用基于一次性絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)該反應(yīng)所產(chǎn)生的電流，繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而建立了檢測(cè)檢測(cè)大腸桿菌的電流型生物傳感方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：反應(yīng)體系最佳PH=7.5，酶促反應(yīng)最佳時(shí)間為45min，樣品中細(xì)菌濃度與電流響應(yīng)值之間呈現(xiàn)良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，方程為Y=1.1346×10~(-6)+1.8950×10~(-5)X，R~2=0.98943(p0.01)，最低檢測(cè)限為103CFU/mL，樣品檢測(cè)時(shí)間低于10分鐘。此方法準(zhǔn)確性和特異性良好，應(yīng)用基于酶反應(yīng)體系的傳感方法檢測(cè)大腸桿菌具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，適合大批量樣品快速篩選。
【關(guān)鍵詞】：大腸桿菌 銅綠假單胞菌 一次性絲網(wǎng)印刷電極 光電型生物傳感器 電流型生物傳感器
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 前言14-24
• 1 大腸埃希氏菌與銅綠假單胞菌污染現(xiàn)狀及危害14-16
• 1.1 大腸桿菌污染現(xiàn)狀及其危害14-15
• 1.2 銅綠假單胞菌污染現(xiàn)狀及其危害15-16
• 2 常見(jiàn)致病菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展16-18
• 2.1 傳統(tǒng)的致病菌檢測(cè)方法16
• 2.2 基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法16-17
• 2.3 基于 PCR 技術(shù)的檢測(cè)方法17
• 2.4 基因芯片技術(shù)在檢測(cè)中的應(yīng)用17-18
• 3 生物傳感器在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用18-22
• 3.1 生物傳感器的工作原理18-19
• 3.2 生物傳感器分類(lèi)及在檢測(cè)病原微生物中的應(yīng)用19-22
• 3.2.1 電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)病原菌中的應(yīng)用20-21
• 3.2.2 光電型生物傳感法在檢測(cè)病原菌中的應(yīng)用21-22
• 4 生物傳感法檢測(cè)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的理論基礎(chǔ)22-23
• 5 本課題的研究主要內(nèi)容和意義23-24
• 第二章 快速檢測(cè)銅綠假單胞菌光電型傳感方法的建立24-40
• 1 材料與方法24-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料24
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法24-33
• 1.2.1 光電型傳感器的設(shè)計(jì)和工作原理24-30
• 1.2.2 光電型傳感器檢測(cè)銅綠假單胞菌的原理30
• 1.2.3 光電型傳感器試紙條的制作30-31
• 1.2.4 反應(yīng)條件的測(cè)定31-32
• 1.2.5 光電傳感法檢測(cè)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制32
• 1.2.6 試紙條穩(wěn)定性檢測(cè)32
• 1.2.7 準(zhǔn)確性和回收率的測(cè)定32-33
• 1.2.8 光電傳感方法檢測(cè)銅綠假單胞菌的效果與傳統(tǒng)的平板法效果對(duì)比33
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-38
• 2.1 便攜式光電型生物傳感器研制結(jié)果33
• 2.2 光電型試紙條制備效果33-34
• 2.3 不同濃度銅綠假單胞菌反應(yīng)后試紙條反射光信號(hào)值隨時(shí)間變化的曲線34
• 2.4 pH 對(duì)試紙條光反射強(qiáng)度影響曲線34-35
• 2.5 最適鹽酸二甲基對(duì)苯二胺濃度35
• 2.6 光電型傳感器檢測(cè)銅綠假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線35-36
• 2.7 試紙條穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果36
• 2.8 準(zhǔn)確率與回收率的檢測(cè)結(jié)果36-37
• 2.9 光電傳感方法檢測(cè)銅綠假單胞菌的效果與傳統(tǒng)的平板法效果對(duì)比37-38
• 3 討論38-39
• 4 結(jié)論39-40
• 第三章 快速檢測(cè)食品中大腸桿菌光電型傳感方法的建立40-51
• 1 材料與方法40-45
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法41-45
• 1.2.1 光電型傳感方法檢測(cè)食品中大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理41
• 1.2.2 光電型傳感器的檢測(cè)過(guò)程41-42
• 1.2.3 大腸桿菌的篩選、培養(yǎng)與反應(yīng)體系的組長(zhǎng)42-43
• 1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化43
• 1.2.5 光電傳感方法檢測(cè)大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制43-44
• 1.2.6 準(zhǔn)確性的測(cè)定44
• 1.2.7 回收率的測(cè)定44
• 1.2.8 光電傳感方法檢測(cè)大腸桿菌的效果與傳統(tǒng)的平板法效果對(duì)比44-45
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-49
• 2.1 光電試紙條制備的檢測(cè)實(shí)物圖45
• 2.2 不同濃度大腸桿菌反應(yīng)后試紙條反射光信號(hào)值隨時(shí)間變化的曲線45-46
• 2.3 不同 pH 顯色反應(yīng)后試紙條光反射強(qiáng)度變化曲線46-47
• 2.4 光電型傳感器檢測(cè)大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線47
• 2.5 準(zhǔn)確率及回收率的檢測(cè)結(jié)果47-48
• 2.6 光電傳感方法檢測(cè)大腸桿菌的效果與傳統(tǒng)的平板法效果對(duì)比48-49
• 3 討論49-50
• 4 結(jié)論50-51
• 第四章 基于β-半乳糖苷酶為生物信標(biāo)的檢測(cè)大腸桿菌的傳感方法51-71
• 1 材料與方法51-61
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料51-52
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法52-61
• 1.2.1 電流型傳感器的設(shè)計(jì)和工作原理52-56
• 1.2.2 電流型傳感器檢測(cè)大腸桿菌的原理56-57
• 1.2.3 大腸桿菌的培養(yǎng)、篩選及保存57
• 1.2.4 反應(yīng)體系的組成57
• 1.2.5 傳感器測(cè)試方法的建立57-59
• 1.2.6 電流型生物傳感方法檢測(cè)大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作59
• 1.2.7 電流型生物傳感方法檢測(cè)大腸桿菌的條件優(yōu)化59
• 1.2.8 準(zhǔn)確度的測(cè)定59-60
• 1.2.9 電流型生物傳感方法檢測(cè)大腸桿菌與平板計(jì)數(shù)法效果比較60-61
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-69
• 2.1 底物 PAPG 的電化學(xué)活性61-62
• 2.2 產(chǎn)物 PAP 的電化學(xué)活性?huà)呙鑸D及標(biāo)準(zhǔn)曲線62-63
• 2.3 電流型傳感器檢測(cè)大腸桿菌的掃描曲線63-65
• 2.4 電流型生物傳感法檢測(cè)大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線65
• 2.5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化65-67
• 2.5.1 促反應(yīng)時(shí)間對(duì)電極響應(yīng)電流的影響65-66
• 2.5.2 支持液 pH 值對(duì)電極響應(yīng)電流的影響66-67
• 2.6 實(shí)驗(yàn)樣品檢測(cè)67-68
• 2.7 準(zhǔn)確性檢測(cè)結(jié)果68-69
• 3 討論69-70
• 4 結(jié)論70-71
• 第五章 全文總結(jié)71-73
• 參考文獻(xiàn)73-82
• 致謝82-83
• 發(fā)表論文情況83

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1008206