本文關鍵詞：六鄰體嵌合型重組5型腺病毒載體復制和包裝機理的研究

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【摘要】：重組5型腺病毒(recombinant adenovirus type5, rAd5)作為基因治療和疫苗載體具有多重優(yōu)勢，然而，預存免疫的存在會顯著的降低該種血清型腺病毒載體的轉導效率以及轉基因表達水平，限制腺病毒作為疫苗以及基因治療載體的應用。利用基因工程改造腺病毒載體，將rAd5表面主要結構蛋白六鄰體的7個高突變區(qū)(HVR區(qū))選擇性地與稀有血清型六鄰體的相應區(qū)域相嵌合是幫助rAd5逃避預存免疫的有效方法。限制這一方法的主要問題是這種嵌合改造過程繁瑣，而且與rAd5相比，許多嵌合改造的方案都降低了嵌合型腺病毒的包裝效率和復制水平，甚至導致改造后的腺病毒不能包裝。與此相關的病毒復制和包裝機理有待進一步的研究。 本論文在課題組前期工作的基礎上，首先通過對幾種與人D亞群腺病毒(37型、43型)六鄰體HVR區(qū)嵌合的重組5型腺病毒[Ad5-GFP、Ad5-37(5,7)-GFP、Ad5-43(5,7)-GFP]復制水平的分析，以及對幾種六鄰體嵌合型重組5型腺病毒骨架質粒[Ad5、Ad5-37(5,7)、Ad5-43(5,7)、Ad5-37(1-7)、Ad5-43(1-7)]蛋白表達量的檢測發(fā)現，對腺病毒六鄰體的改造影響了六鄰體在細胞內的豐度和聚集狀態(tài)，最終導致嵌合腺病毒的復制水平和包裝效率的降低。接著，為了更深入地了解嵌合改造的腺病毒六鄰體對其生物活性的影響，我們構建了相應的幾種嵌合型六鄰體的真核表達質粒[5Hexon、5Hexon-37(5,7)、5Hexon-37(1-7)、5Hexon-43(5,7)、5Hexon-43(1-7)]，檢測了幾種嵌合型六鄰體與其伴侶蛋白5型腺病毒L4-100K(5-100K)的相互作用。通過對5-100K對六鄰體表達量、形成三聚體及進入細胞核三個方面的影響進行檢測，我們發(fā)現，雖然嵌合改造后的5型腺病毒六鄰體都能夠在5型L4-100K的幫助下提高表達量，但是不同的改造方案卻不同程度地影響了嵌合六鄰體在5型L4-100K的幫助下形成三聚體的效率以及進入細胞核的效率，而這些改變也和嵌合型腺病毒包裝重組效率以及復制水平的改變是一致的。最后，我們將5型L4-100K(5-100K)更換成D亞群L4-100K(D-100K)，并重新檢測了D-100K與幾種嵌合型六鄰體[5Hexon-37(1-7)、5Hexon-43(1-7)]的相互作用，發(fā)現血清型特異性在嵌合型六鄰體形成三聚體的過程中并不是主要影響因素，進一步確定了HVR區(qū)嵌合對腺病毒六鄰體自身形成三聚體的穩(wěn)定性造成影響，從而改變了嵌合型腺病毒包裝重組效率和復制水平。 本論文的研究表明，，對腺病毒六鄰體的嵌合改造影響了六鄰體自身形成三聚體的穩(wěn)定性，使得嵌合六鄰體在其伴侶蛋白L4-100K的幫助下形成三聚體和進入細胞核參與組裝的效率改變，是六鄰體的嵌合改造影響腺病毒包裝效率和復制水平的主要原因，并且闡明了相關的腺病毒包裝機理。另外，通過本論文的研究，我們建立了一種新的有效評價六鄰體嵌合方案的平臺，即通過檢測六鄰體與L4-100K相互作用來評價和預測嵌合改造腺病毒六鄰體的策略對病毒包裝復制影響的快速有效方法。通過該方法能夠有效排除影響腺病毒包裝復制的嵌合改造方案，大大提高了對腺病毒六鄰體進行改造后得到六鄰體嵌合型重組腺病毒的成功率。
【關鍵詞】：重組腺病毒載體 六鄰體嵌合 L4-100K HVR
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R450;R373
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 腺病毒簡介12-16
• 1.1.1 腺病毒的結構和分類12-13
• 1.1.2 腺病毒的復制周期13-15
• 1.1.3 腺病毒衣殼的裝配15-16
• 1.2 腺病毒載體的應用16-19
• 1.2.1 腺病毒載體簡介17
• 1.2.2 腺病毒載體的特點和面臨的問題17-18
• 1.2.3 腺病毒載體逃避預存免疫的方法和現有方法的局限18-19
• 1.3 論文設計19-22
• 1.3.1 立題依據19-21
• 1.3.2 實驗方案21-22
• 第二章 實驗材料與方法22-34
• 2.1 實驗材料、儀器設備與常用試劑22-30
• 2.1.1 實驗材料22-24
• 2.1.2 儀器設備24
• 2.1.3 常用試劑和緩沖液配置24-30
• 2.2 實驗方法30-34
• 2.2.1 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒的篩選30-31
• 2.2.2 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒的感染和擴增31
• 2.2.3 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒滴度的測定31-32
• 2.2.4 病毒骨架質粒蛋白表達量的測定32-33
• 2.2.5 嵌合六鄰體三聚體形成效率的測定33
• 2.2.6 嵌合六鄰體進入細胞核效率的測定33-34
• 第三章 實驗結果與討論34-58
• 3.1 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒的產率34-37
• 3.2 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒骨架質粒蛋白表達效率37-40
• 3.3 嵌合六鄰體和其伴侶蛋白 L4-100K 真核質粒的構建40-46
• 3.3.1 六鄰體伴侶蛋白 100K 真核質粒的構建40-42
• 3.3.2 重組 5 型腺病毒六鄰體真核質粒的構建42-43
• 3.3.3 嵌合型 5 型六鄰體真核質粒的構建43-46
• 3.4 嵌合六鄰體形成三聚體的效率46-50
• 3.4.1 六鄰體伴侶蛋白 L4-100K 的真核表達46
• 3.4.2 嵌合六鄰體真核質粒的真核表達46-48
• 3.4.3 嵌合六鄰體形成三聚體的效率48-50
• 3.5 血清型特異性對嵌合六鄰體與 L4-100K 的相互作用的影響50-54
• 3.5.1 D 亞群六鄰體伴侶蛋白 L4-100K 真核質粒的構建50-51
• 3.5.2 37 型腺病毒六鄰體真核質粒的構建51-52
• 3.5.3 D-100K 和 37 型六鄰體的表達52-53
• 3.5.4 血清型的改變在六鄰體與 L4-100K 相互作用中的影響53-54
• 3.6 嵌合六鄰體進入細胞核的效率54-58
• 結論58-60
• 展望60-61
• 參考文獻61-64
• 作者簡歷64-65
• 致謝65

【參考文獻】

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1 譚耀駒;謝菲;;腺病毒分型診斷研究進展[J];廣東醫(yī)學;2008年01期

本文編號：1005515