發(fā)布時(shí)間：2017-10-10 09:11

  本文關(guān)鍵詞：六鄰體嵌合型重組5型腺病毒載體復(fù)制和包裝機(jī)理的研究

  更多相關(guān)文章： 重組腺病毒載體 六鄰體嵌合 L4-100K HVR

【摘要】：重組5型腺病毒(recombinant adenovirus type5, rAd5)作為基因治療和疫苗載體具有多重優(yōu)勢(shì)，然而，預(yù)存免疫的存在會(huì)顯著的降低該種血清型腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，限制腺病毒作為疫苗以及基因治療載體的應(yīng)用。利用基因工程改造腺病毒載體，將rAd5表面主要結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體的7個(gè)高突變區(qū)(HVR區(qū))選擇性地與稀有血清型六鄰體的相應(yīng)區(qū)域相嵌合是幫助rAd5逃避預(yù)存免疫的有效方法。限制這一方法的主要問(wèn)題是這種嵌合改造過(guò)程繁瑣，而且與rAd5相比，許多嵌合改造的方案都降低了嵌合型腺病毒的包裝效率和復(fù)制水平，甚至導(dǎo)致改造后的腺病毒不能包裝。與此相關(guān)的病毒復(fù)制和包裝機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。 本論文在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，首先通過(guò)對(duì)幾種與人D亞群腺病毒(37型、43型)六鄰體HVR區(qū)嵌合的重組5型腺病毒[Ad5-GFP、Ad5-37(5,7)-GFP、Ad5-43(5,7)-GFP]復(fù)制水平的分析，以及對(duì)幾種六鄰體嵌合型重組5型腺病毒骨架質(zhì)粒[Ad5、Ad5-37(5,7)、Ad5-43(5,7)、Ad5-37(1-7)、Ad5-43(1-7)]蛋白表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)腺病毒六鄰體的改造影響了六鄰體在細(xì)胞內(nèi)的豐度和聚集狀態(tài)，最終導(dǎo)致嵌合腺病毒的復(fù)制水平和包裝效率的降低。接著，為了更深入地了解嵌合改造的腺病毒六鄰體對(duì)其生物活性的影響，我們構(gòu)建了相應(yīng)的幾種嵌合型六鄰體的真核表達(dá)質(zhì)粒[5Hexon、5Hexon-37(5,7)、5Hexon-37(1-7)、5Hexon-43(5,7)、5Hexon-43(1-7)]，檢測(cè)了幾種嵌合型六鄰體與其伴侶蛋白5型腺病毒L4-100K(5-100K)的相互作用。通過(guò)對(duì)5-100K對(duì)六鄰體表達(dá)量、形成三聚體及進(jìn)入細(xì)胞核三個(gè)方面的影響進(jìn)行檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，雖然嵌合改造后的5型腺病毒六鄰體都能夠在5型L4-100K的幫助下提高表達(dá)量，但是不同的改造方案卻不同程度地影響了嵌合六鄰體在5型L4-100K的幫助下形成三聚體的效率以及進(jìn)入細(xì)胞核的效率，而這些改變也和嵌合型腺病毒包裝重組效率以及復(fù)制水平的改變是一致的。最后，我們將5型L4-100K(5-100K)更換成D亞群L4-100K(D-100K)，并重新檢測(cè)了D-100K與幾種嵌合型六鄰體[5Hexon-37(1-7)、5Hexon-43(1-7)]的相互作用，發(fā)現(xiàn)血清型特異性在嵌合型六鄰體形成三聚體的過(guò)程中并不是主要影響因素，進(jìn)一步確定了HVR區(qū)嵌合對(duì)腺病毒六鄰體自身形成三聚體的穩(wěn)定性造成影響，從而改變了嵌合型腺病毒包裝重組效率和復(fù)制水平。 本論文的研究表明，，對(duì)腺病毒六鄰體的嵌合改造影響了六鄰體自身形成三聚體的穩(wěn)定性，使得嵌合六鄰體在其伴侶蛋白L4-100K的幫助下形成三聚體和進(jìn)入細(xì)胞核參與組裝的效率改變，是六鄰體的嵌合改造影響腺病毒包裝效率和復(fù)制水平的主要原因，并且闡明了相關(guān)的腺病毒包裝機(jī)理。另外，通過(guò)本論文的研究，我們建立了一種新的有效評(píng)價(jià)六鄰體嵌合方案的平臺(tái)，即通過(guò)檢測(cè)六鄰體與L4-100K相互作用來(lái)評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)嵌合改造腺病毒六鄰體的策略對(duì)病毒包裝復(fù)制影響的快速有效方法。通過(guò)該方法能夠有效排除影響腺病毒包裝復(fù)制的嵌合改造方案，大大提高了對(duì)腺病毒六鄰體進(jìn)行改造后得到六鄰體嵌合型重組腺病毒的成功率。
【關(guān)鍵詞】：重組腺病毒載體 六鄰體嵌合 L4-100K HVR
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R450;R373
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 腺病毒簡(jiǎn)介12-16
• 1.1.1 腺病毒的結(jié)構(gòu)和分類12-13
• 1.1.2 腺病毒的復(fù)制周期13-15
• 1.1.3 腺病毒衣殼的裝配15-16
• 1.2 腺病毒載體的應(yīng)用16-19
• 1.2.1 腺病毒載體簡(jiǎn)介17
• 1.2.2 腺病毒載體的特點(diǎn)和面臨的問(wèn)題17-18
• 1.2.3 腺病毒載體逃避預(yù)存免疫的方法和現(xiàn)有方法的局限18-19
• 1.3 論文設(shè)計(jì)19-22
• 1.3.1 立題依據(jù)19-21
• 1.3.2 實(shí)驗(yàn)方案21-22
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法22-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備與常用試劑22-30
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2.1.2 儀器設(shè)備24
• 2.1.3 常用試劑和緩沖液配置24-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-34
• 2.2.1 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒的篩選30-31
• 2.2.2 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒的感染和擴(kuò)增31
• 2.2.3 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒滴度的測(cè)定31-32
• 2.2.4 病毒骨架質(zhì)粒蛋白表達(dá)量的測(cè)定32-33
• 2.2.5 嵌合六鄰體三聚體形成效率的測(cè)定33
• 2.2.6 嵌合六鄰體進(jìn)入細(xì)胞核效率的測(cè)定33-34
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論34-58
• 3.1 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒的產(chǎn)率34-37
• 3.2 六鄰體嵌合型重組 5 型腺病毒骨架質(zhì)粒蛋白表達(dá)效率37-40
• 3.3 嵌合六鄰體和其伴侶蛋白 L4-100K 真核質(zhì)粒的構(gòu)建40-46
• 3.3.1 六鄰體伴侶蛋白 100K 真核質(zhì)粒的構(gòu)建40-42
• 3.3.2 重組 5 型腺病毒六鄰體真核質(zhì)粒的構(gòu)建42-43
• 3.3.3 嵌合型 5 型六鄰體真核質(zhì)粒的構(gòu)建43-46
• 3.4 嵌合六鄰體形成三聚體的效率46-50
• 3.4.1 六鄰體伴侶蛋白 L4-100K 的真核表達(dá)46
• 3.4.2 嵌合六鄰體真核質(zhì)粒的真核表達(dá)46-48
• 3.4.3 嵌合六鄰體形成三聚體的效率48-50
• 3.5 血清型特異性對(duì)嵌合六鄰體與 L4-100K 的相互作用的影響50-54
• 3.5.1 D 亞群六鄰體伴侶蛋白 L4-100K 真核質(zhì)粒的構(gòu)建50-51
• 3.5.2 37 型腺病毒六鄰體真核質(zhì)粒的構(gòu)建51-52
• 3.5.3 D-100K 和 37 型六鄰體的表達(dá)52-53
• 3.5.4 血清型的改變?cè)诹忬w與 L4-100K 相互作用中的影響53-54
• 3.6 嵌合六鄰體進(jìn)入細(xì)胞核的效率54-58
• 結(jié)論58-60
• 展望60-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 作者簡(jiǎn)歷64-65
• 致謝65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 譚耀駒;謝菲;;腺病毒分型診斷研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2008年01期

本文編號(hào)：1005515