本文關鍵詞：脂肪干細胞向雪旺細胞誘導分化及組織工程化周圍神經(jīng)構建的實驗研究

  更多相關文章： 神經(jīng)組織工程 支架材料 種子細胞 冷凍干燥 脂肪干細胞 PKH26

【摘要】：目的： 1.探討兔坐骨神經(jīng)損傷后內(nèi)源性堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)及腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的變化規(guī)律；并研究兔坐骨神經(jīng)勻漿上清液對脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)的誘導分化作用。 2.探討低滲聯(lián)合凍干技術改良制備脫細胞周圍神經(jīng)支架的可行性,檢測其理化性能。 3.探討以改良脫細胞神經(jīng)支架復合ADSCs構建組織工程化周圍神經(jīng)的可行性。方法： 1.采用鉗夾法制作兔坐骨神經(jīng)損傷模型,分別于未損傷、損傷第3天、第7天及第14天取坐骨神經(jīng)制備組織勻漿,采用ELISA方法檢測坐骨神經(jīng)勻漿上清液中bFGF、NGF及BDNF的含量。分離、培養(yǎng)兔ADSCs,將第3代ADSCs分別采用各組坐骨神經(jīng)勻漿上清液培養(yǎng),顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,7天后通過實時熒光定量PCR檢測其向雪旺細胞定向分化的能力。 2.采用低滲聯(lián)合凍干技術對傳統(tǒng)脫細胞神經(jīng)支架材料進行改良,脫細胞完成后采用病理HE染色、免疫熒光及掃描電鏡方法對其進行組織學評估；利用Mimics軟件對其孔隙率及孔隙直徑進行測量；采用Endura TEC ELF3200力學儀器對其力學性能進行測試：并采用MTT法檢測支架浸提液對ADSCs增殖的影響：Live/Dead染色觀察細胞在支架上的活性。 3.在體式顯微鏡下,將第3代脂肪干細胞與改良脫細胞神經(jīng)支架采用顯微注射法進行復合,構建組織工程化周圍神經(jīng),采用HE染色、掃描電鏡觀察細胞在支架上生長、存活情況。同時,將上述細胞進行PKH26標記,檢測PKH26標記前后細胞生物學特性；將細胞以密度1×107個/ml接種至支架上,細胞支架復合物體外培養(yǎng)1周后,將其植入裸鼠背部皮下：體內(nèi)培養(yǎng)4周后,采用小動物活體熒光成像系統(tǒng)檢測體內(nèi)細胞支架復合物熒光分布情況；處死裸鼠,取出細胞支架復合體,將其冰凍切片后,熒光顯微鏡下觀察。 結果： 1.坐骨神經(jīng)損傷后bFGF.NGF及BDNF的分泌均隨損傷后時間的變化而波動,均于第3-7天達到峰值,之后下降；ADSCs體外培養(yǎng)呈長梭形,增殖迅速,穩(wěn)定性好,經(jīng)損傷坐骨神經(jīng)勻漿上清液誘導后具有雪旺細胞樣形態(tài)；熒光定量PCR顯示：S-100蛋白基因表達量隨著損傷時間的延長呈上升趨勢,于損傷3天組及損傷7天組達到高峰(P0.05),之后緩慢下降。 2.HE染色及掃描電鏡觀察顯示支架內(nèi)髓鞘、細胞及軸突等結構均消失,可見平行排列的基底膜管；支架孔隙率為49.3%±9.8%,孔隙直徑為(17.6+3.7)μm；支架彈性模量為2.45±0.65MPa:經(jīng)MTT測定支架浸提液對細胞的增殖無影響；Live/Dead染色可見細胞在支架上生長良好。 3.PKH26能有效標記ADSCs,標記率為95.12%,MTT檢測及成骨、成脂、成軟骨誘導結果顯示,PKH26標記對細胞增殖及多向分化潛能沒有影響；細胞支架復合物裸鼠皮下培養(yǎng)4周后,肉眼觀察在裸鼠皮下植入部位周圍無感染及炎癥反應,小動物活體熒光成像系統(tǒng)顯示在支架上可見熒光分布；處死裸鼠冰凍切片后,熒光顯微鏡下可見紅色熒光。 結論： 1.在周圍神經(jīng)損傷后的早期修復過程中,神經(jīng)組織能夠迅速調(diào)節(jié)NGF.bFGF及BDNF的分泌,各因子的分泌調(diào)節(jié)與損傷時間有關,呈峰值效應；兔損傷坐骨神經(jīng)勻漿上清液在體外能夠有效地誘導ADSCs分化為雪旺細胞,傷后早期(3-7天)可以作為細胞移植的最佳時間。 2.低滲聯(lián)合凍干技術改良制備的脫細胞神經(jīng)支架,具有良好的孔隙率及孔隙直徑,良好的生物力學特性,無毒,細胞相容性良好,可作為一種更有利于細胞復合的神經(jīng)支架材料。 3.以改良脫細胞神經(jīng)支架復合脂肪干細胞可以初步構建組織工程化周圍神經(jīng)。
【關鍵詞】：神經(jīng)組織工程 支架材料 種子細胞 冷凍干燥 脂肪干細胞 PKH26
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-14
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、兔坐骨神經(jīng)損傷后內(nèi)源性生長因子含量的變化及意義14-21
• 1.1 對象和方法14-16
• 1.1.1 實驗材料及試劑14
• 1.1.2 實驗試劑配制14
• 1.1.3 實驗儀器14
• 1.1.4 實驗方法14-16
• 1.1.5 統(tǒng)計學分析16
• 1.2 結果16
• 1.2.1 兔坐骨神經(jīng)損傷模型的觀察16
• 1.2.2 各組中神經(jīng)勻漿上清液生長因子含量的變化16
• 1.3 討論16-18
• 1.3.1 組織勻漿與神經(jīng)營養(yǎng)因子16-17
• 1.3.2 神經(jīng)修復與神經(jīng)再生17
• 1.3.3 干細胞治療神經(jīng)損傷17-18
• 1.4 小結18-19
• 附圖19-21
• 二、兔坐骨神經(jīng)勻漿上清液對脂肪干細胞的誘導分化作用21-32
• 2.1 對象和方法21-27
• 2.1.1 實驗材料及試劑21
• 2.1.2 實驗試劑配制21-22
• 2.1.3 實驗儀器22-23
• 2.1.4 實驗方法23-27
• 2.1.5 統(tǒng)計學分析27
• 2.2 結果27
• 2.2.1 ADSCs的形態(tài)學觀察27
• 2.2.2 ADSCs向神經(jīng)系細胞誘導時的形態(tài)變化27
• 2.2.3 實時熒光定量PCR檢測結果27
• 2.3 討論27-29
• 2.3.1 酶消化法分離提取ADSCs28
• 2.3.2 干細胞與其所處微環(huán)境的關系28-29
• 2.4 小結29-30
• 附圖30-32
• 三、低滲聯(lián)合凍干技術改良制備組織工程神經(jīng)支架及其性能研究32-44
• 3.1 對象和方法32-36
• 3.1.1 實驗材料及試劑32
• 3.1.2 實驗試劑配制32
• 3.1.3 實驗儀器32-33
• 3.1.4 實驗方法33-35
• 3.1.5 統(tǒng)計學分析35-36
• 3.2 結果36
• 3.2.1 支架組織學觀察36
• 3.2.2 支架Laminin免疫熒光染色36
• 3.2.3 支架掃描電鏡觀察36
• 3.2.4 支架生物力學性能36
• 3.2.5 支架材料細胞相容性36
• 3.3 討論36-38
• 3.3.1 支架材料與神經(jīng)組織工程37
• 3.3.2 低滲凍干改良制備脫細胞神經(jīng)支架材料37
• 3.3.3 支架的理化性能及細胞相容性37-38
• 3.4 小結38-39
• 附圖39-44
• 四、以改良脫細胞神經(jīng)支架復合脂肪干細胞體外及裸鼠體內(nèi)異位構建組織工程化周圍神經(jīng)的實驗研究44-57
• 4.1 對象和方法44-47
• 4.1.1 實驗材料及試劑44
• 4.1.2 實驗試劑配制44
• 4.1.3 實驗儀器44
• 4.1.4 實驗方法44-47
• 4.1.5 統(tǒng)計學分析47
• 4.2 結果47-48
• 4.2.1 PKH26標記ADSCs結果47
• 4.2.2 組織工程化周圍神經(jīng)體外培養(yǎng)及觀察47
• 4.2.3 裸鼠皮下植入實驗47-48
• 4.3 討論48-50
• 4.3.1 PKH26標記ADSCs48-49
• 4.3.2 小動物活體成像系統(tǒng)分析49
• 4.3.3 ADSCs與改良脫細胞神經(jīng)支架在裸鼠皮下以為構建組織工程神經(jīng)的可行性49-50
• 4.4 小結50-51
• 附圖51-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-66
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明66-67
• 綜述67-75
• 綜述參考文獻72-75
• 致謝75-76

【參考文獻】

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9 任志午;趙U，

本文編號：1004077