本文關(guān)鍵詞：靶向調(diào)控IFITM5基因的miR-762抑制Saos-2細(xì)胞礦化的研究

  更多相關(guān)文章： IFITM5基因 靶基因 成骨細(xì)胞 礦化 miR-762

【摘要】：干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白5(interferon induced transmembrane protein5, IFITM5)是干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白家族成員之一，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化的作用。在成骨細(xì)胞分化階段表達(dá)量增加，尤其是骨基質(zhì)形成期和礦化階段達(dá)到峰值。Ⅴ型成骨不全患者中均發(fā)現(xiàn)存在IFITM5基因的5'UTR的c.-14C T突變，該類患者臨床特征主要是前臂骨間膜鈣化和增生性骨痂形成。 microRNA(miRNA)是一類長度21-23個核苷酸，廣泛存在于多物種的內(nèi)源性、非編碼單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。己證實(shí)miRNA廣泛參與了多種生理病理過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡。研究表明miRNA可靶向調(diào)控成骨細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵基因以調(diào)控成骨細(xì)胞的分化。但是，到目前為止，還沒有生物學(xué)證據(jù)發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控成骨細(xì)胞礦化相關(guān)基因IFITM5的miRNA，從而調(diào)控成骨細(xì)胞的礦化。 目的：本研究旨在發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)控IFITM5基因的microRNA，并驗(yàn)證microRNA對成骨細(xì)胞礦化、分化的影響。 方法：應(yīng)用TargetScan、miRanda、Microcosm和DIANA-microT等4個靶標(biāo)預(yù)測軟件中至少兩個預(yù)測結(jié)果的交集來判定microRNA和IFITM5是否存在靶標(biāo)關(guān)系。人工合成microRNA mimics，并構(gòu)建野生型、突變型pmirGLO-IFITM5-3'UTR雙熒光素酶報告載體，通過FuGENE HD轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，檢測螢火蟲熒光素酶相對活性以篩選出結(jié)合于IFITM5-3'UTR的microRNA，進(jìn)一步通過Western blotting檢測篩選出顯著下調(diào)IFITM5蛋白的microRNA。最終篩選出的microRNA轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞后，誘導(dǎo)礦化后采用茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，并應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR檢測分化標(biāo)志蛋白ALP、OCN、Runx2等基因的表達(dá)。 結(jié)果：(1)生物信息學(xué)預(yù)測出28個相關(guān)microRNA，其中15個為三個及以上數(shù)據(jù)庫共有。(2)通過野生型雙熒光素酶報告載體與microRNA mimics共轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，以實(shí)驗(yàn)組熒光值相對于對照組下調(diào)30%以上為原則，篩選出miR-1296、miR-2861、miR-4316、miR-661、miR-762；構(gòu)建上述五個突變型雙熒光素酶報告載分別與各自microRNA mimics共轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，篩選出miR-2861、miR-4316、miR-762。(3)將上述三個microRNA轉(zhuǎn)染到Saos-2細(xì)胞，Western blotting結(jié)果顯示miR-762、miR-4316顯著降低IFITM5蛋白表達(dá)水平。(4)茜素紅染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對于空白對照組，在誘導(dǎo)礦化72h后miR-762組均抑制礦化結(jié)節(jié)的形成；實(shí)時熒光定量PCR檢測礦化標(biāo)志蛋白ALP、OCN、Runx2，相比于對照組，，miR-762組ALP、OCN、Runx2的mRNA表達(dá)量均下降。 結(jié)論：篩選出負(fù)向調(diào)控IFITM5的miR-762、miR-4316，并驗(yàn)證了miR-762抑制成骨細(xì)胞礦化的作用。
【關(guān)鍵詞】：IFITM5基因 靶基因 成骨細(xì)胞 礦化 miR-762
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 導(dǎo)師簡介5
• 課題組成員5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 主要符號表12-13
• 前言13-18
• 1 IFITM5 基因13-15
• 1.1 家族成員13
• 1.2 功能及調(diào)控機(jī)制13-14
• 1.3 IFITM5 與Ⅴ型成骨不全14-15
• 2 microRNA 與成骨細(xì)胞15-18
• 2.1 microRNA 生物學(xué)起源15-16
• 2.2 靶基因的預(yù)測和驗(yàn)證16
• 2.3 microRNA 與成骨細(xì)胞16-18
• 第一章 靶向調(diào)控 IFITM5 基因的 microRNA 篩選18-36
• 1 材料與方法18-29
• 1.1 材料18-20
• 1.1.1 細(xì)胞18
• 1.1.2 試劑18-20
• 1.1.3 儀器20
• 1.2 方法20-29
• 1.2.1 microRNA 生物信息學(xué)預(yù)測20-21
• 1.2.2 Saos-2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染21
• 1.2.3 T-IFITM5-3'UTR 重組載體的構(gòu)建21-24
• 1.2.4 pmirGLO-IFITM5-W-3'UTR 重組載體的構(gòu)建24-25
• 1.2.5 pmirGLO-IFITM5-Mut-3'UTR 重組載體的構(gòu)建25-26
• 1.2.6 熒光素酶活性的檢測26-27
• 1.2.7 Western blotting 檢測 IFITM5 蛋白表達(dá)27-29
• 2 結(jié)果29-33
• 2.1 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果29
• 2.2 擴(kuò)增結(jié)果29-30
• 2.3 重組載體的酶切鑒定30-31
• 2.3.1 pmirGLO-IFITM5-W-3'UTR 酶切驗(yàn)證30
• 2.3.2 pmirGLO-IFITM5-Mut-3'UTR 酶切鑒定30-31
• 2.4 重組載體的測序鑒定31
• 2.5 熒光素酶活性的檢測31-33
• 2.6 Western blotting 檢測 IFITM5 蛋白表達(dá)33
• 3 討論33-36
• 第二章 miR-762 對 Saos-2 細(xì)胞礦化的功能研究36-44
• 1 材料與方法36-40
• 1.1 材料36-37
• 1.1.1 細(xì)胞36
• 1.1.2 試劑36-37
• 1.1.3 儀器37
• 1.2 方法37-40
• 1.2.1 Saos-2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染37
• 1.2.2 miR-762 定量檢測37-38
• 1.2.3 茜素紅染色38-39
• 1.2.4 ALP、OCN、Runx2 定量檢測39-40
• 2 結(jié)果40-42
• 2.1 Saos-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后 miR-762 的表達(dá)變化40-41
• 2.2 茜素紅染色法檢測 Saos-2 細(xì)胞的礦化程度41
• 2.3 Real-time PCR 檢測各組 Runx2、ALP、OCN 的 mRNA 的表達(dá)41-42
• 3 討論42-44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 附錄51-53
• 綜述53-62
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 在校期間發(fā)表論文62-63
• 致謝63

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 莫新凱;靶向調(diào)控IFITM5基因的miR-762抑制Saos-2細(xì)胞礦化的研究[D];濟(jì)南大學(xué);2014年

本文編號：1004488