發(fā)布時(shí)間：2017-08-13 07:37

  本文關(guān)鍵詞：MiR-143靶向PD-L1在電離輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：隨著核能在軍事武器裝各領(lǐng)域、工業(yè)領(lǐng)域、醫(yī)療領(lǐng)域以及科學(xué)研究等領(lǐng)域的應(yīng)用不斷普及和擴(kuò)大,核能就像一把雙刃劍,一方面能夠極大造福我們?nèi)祟?而另一方面則給我們帶來了日益嚴(yán)重的電離輻射危害。而作為電離輻射最重要的遠(yuǎn)后效應(yīng)之一,輻射致癌的發(fā)生率隨著民眾接觸到電離輻射的機(jī)會(huì)越來越多而不斷增加,已經(jīng)受到了輻射相關(guān)從業(yè)人員以及普通民眾的廣泛關(guān)注。除了輻射致癌能直接對(duì)人員健康造成巨大的傷害,還由于輻射致癌的潛伏期長(zhǎng)以及電離輻射看不見摸不著的特點(diǎn)會(huì)對(duì)民眾造成巨大的心理恐慌,因此輻射致癌已經(jīng)引起研究人員廣泛的關(guān)注并開展了多方面的研究。MicroRNA(縮寫為miRNA)又稱小分子RNA或者微小RNA,是真核生物內(nèi)的一類內(nèi)源性的單鏈RNA,一般由21-25個(gè)核苷酸構(gòu)成。首先由DNA轉(zhuǎn)錄形成長(zhǎng)度300-1000個(gè)堿基的pri-miRNA(primary transcript),經(jīng)過一次加工后成為長(zhǎng)度70-90個(gè)堿基的miRNA前體pre-miRNA,再經(jīng)過Dicer酶切成為長(zhǎng)度21-25個(gè)堿基的成熟miRNA。作為非編碼RNA,miRNA不是像別的mRNA那樣通過中心法則中的翻譯過程合成蛋白質(zhì)來發(fā)揮其生物學(xué)功能,而是與靶基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA 3'端非編碼區(qū)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)來相互結(jié)合,從而抑制靶基因翻譯成蛋白起到沉默靶基因表達(dá)的作用。自1993年最先在線蟲中發(fā)現(xiàn)了miRNA,隨后在病毒、植物以及動(dòng)物等上面發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計(jì)的miRNA,而每個(gè)miRNA又可以作用于幾十甚至上百個(gè)靶基因,因此,miRNA雖小,但它調(diào)控的范圍非常廣,在正常的基因表達(dá)過程中發(fā)揮了極其重要的調(diào)節(jié)作用。MiRNA的高度保守性決定了miRNA在調(diào)控生物體最基本最重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、發(fā)育、免疫、腫瘤發(fā)生等一系列極為重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮了不可或缺的調(diào)節(jié)作用。最新研究發(fā)現(xiàn),在多種癌癥中許多miRNA分別出現(xiàn)了明顯的高表達(dá)或者低表達(dá),這其中約有一半得到注解的miRNA基因組定位于和腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn),這說明niRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。根據(jù)miRNA對(duì)腫瘤的調(diào)控作用,按功能可將miRNA分為癌基因樣miRNA (OncomiR),如miR-21,以及抑癌樣基因(Anti-oncomiR),如let-7。其中癌基因樣miRNA的高表達(dá)或者抑癌基因樣miRNA的低表達(dá)都會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,反過來,癌基因樣miRNA的低表達(dá)或者抑癌基因樣miRNA的高表達(dá)則會(huì)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本教研室的課題組近年來一直從事輻射致癌方面的研究,已經(jīng)通過多次分開低劑量照射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤成功建立了小鼠的輻射致癌模型,并對(duì)輻射致癌過程中與正常組織相比表達(dá)差異比較大的蛋白、基因和miRNA進(jìn)行了初步的研究。篩選出了一些表達(dá)差異比較明顯的miRNA進(jìn)行輻射致癌相關(guān)的后續(xù)研究,miR-143就是其中之一。MiR-143最早于2002年由Lagos-Quintana等從小鼠身上首次發(fā)現(xiàn),人的miR-143位于5號(hào)染色體上33號(hào)位點(diǎn)。miR-143表達(dá)高度保守,已知的miR-143的靶基因有Klf4、Elk1、ADD3等,miR-143主要與心臟發(fā)育和癌癥相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)miR-143屬于抑癌基因樣miRNA,它在胰腺癌、白血病、淋巴癌、骨肉瘤、肺癌、膀胱癌等細(xì)胞系中均表達(dá)明顯下調(diào)。目前對(duì)輻射致癌的分子機(jī)制研究還多停留在單個(gè)信號(hào)通路上,還不夠系統(tǒng),離徹底揭示輻射致癌分子機(jī)制還有很長(zhǎng)的路要走。對(duì)于niRNA在輻射致癌中的作用以及如何利用miRNA用于腫瘤的防治方面的研究還有待進(jìn)一步的擴(kuò)展和深入。本課題組通過miRNA芯片結(jié)果結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中miR-143作用的靶蛋白很可能是PD-L1。PD-L1 (Programmed cell death ligand 1)是程序性細(xì)胞死亡受體1(Programmed cell death 1, PD-1)的配體之一,亦稱CD274 (Cluster of differentiation 274)或者B7-H1 (B7 homolog 1)。1999年中國科學(xué)家陳列平率先發(fā)現(xiàn)了PD-L1,隨后Dong等首次采用cDNA表達(dá)序列標(biāo)簽克隆出人B7-H1分子,而Freeman等發(fā)現(xiàn)它能夠直接結(jié)合PD-1,然后發(fā)揮抑制T細(xì)胞活化的功能,遂將它稱為PD-L1。作為B7免疫球蛋白超家族的第三個(gè)成員,它是一個(gè)分子量在40kD左右由290個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜糖蛋白,與B7-DC(PD-L2, PD-1的另一個(gè)配體)、B7-1、B7-2以及ICOS的氨基酸同源性分別為40%、21%、20%和23%。人類的PD-L1基因位于9號(hào)染色體,而小鼠的則位于19號(hào)染色體,但它們相同的結(jié)構(gòu)是都由短而帶電的胞漿區(qū)、疏水結(jié)構(gòu)的跨膜區(qū)以及包含一個(gè)免疫球蛋白V和一個(gè)免疫球蛋白C結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū)三部分構(gòu)成。PD-L1的mRNA主要以4.2kb的形式存在,但也同時(shí)還以1.8kb、3.7kb以及7.2kb的不同轉(zhuǎn)錄形式存在。PD-L1廣泛表達(dá)于正常組織中的APC、T/B淋巴細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞、多種間質(zhì)細(xì)胞等淋巴組織相關(guān)細(xì)胞,它主要通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫細(xì)胞的活性來抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)性。PD-L1還在大多數(shù)的腫瘤組織中表達(dá),而且是高表達(dá),但在腫瘤旁邊的正常組織中卻是低表達(dá),這提示我們它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用�；赑D-L1通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)性在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,而miRNA與多種癌癥相關(guān),并且在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,本文將miRNA與免疫負(fù)性共刺激分子PD-L1相結(jié)合,從利用miRNA調(diào)控PD-L1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的角度來闡明PD-L1在輻射致癌中的作用,并初步探索通過調(diào)控PD-L1來防治輻射致癌的作用及其作用機(jī)制。研究?jī)?nèi)容：1.MiR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用：①觀察正常小鼠胸腺組織與輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤組織中miR-143的表達(dá)差異；②分別觀察上調(diào)、下調(diào)miR-143對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響；③觀察EL4細(xì)胞中上調(diào)miR-143表達(dá)對(duì)細(xì)胞裸鼠荷瘤成功率及腫瘤生長(zhǎng)的影響。2.MiR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用機(jī)制：①預(yù)測(cè)miR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用PD-L1影響輻射誘導(dǎo)胸腺瘤的發(fā)生發(fā)展；②通過Rescue實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證PD-L1確實(shí)是miR-143的靶蛋白。3.電離輻射對(duì)PD-L1表達(dá)的影響以及輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中miR-143與PD-L1表達(dá)之間的關(guān)系：①觀察同一劑量照后不同時(shí)間以及不同劑量照后同一時(shí)間小鼠胸腺組織PD-L1表達(dá)變化；②觀察正常小鼠胸腺組織和輻射誘導(dǎo)胸腺瘤小鼠胸腺組織中PD-L1表達(dá)的差異；③觀察輻射誘導(dǎo)胸腺瘤小鼠胸腺組織中miR-143與PD-L1表達(dá)之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)方法：1.γ射線照射條件：采用實(shí)驗(yàn)用鈷-60γ射線進(jìn)行照射,劑量率為每分鐘0.58Gy。2.細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清以及每毫升培養(yǎng)基各加入100單位的青霉素和鏈霉素；小鼠淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞培養(yǎng)條件為RMPI-1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清以及每毫升培養(yǎng)基各加入100單位的青霉素和鏈霉素,于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定：采用SYBRGreen Ⅰ法,利用羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀通過產(chǎn)物溶解曲線來進(jìn)行相對(duì)定量。4.細(xì)胞活力檢測(cè)：MTT法檢測(cè)細(xì)胞的光密度值來確定細(xì)胞的增殖與活性。5.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用Annexin Ⅴ/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒通過流式細(xì)胞儀來檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率。6.蛋白表達(dá)檢測(cè)：通過與特異性抗體結(jié)合利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度或者抗體標(biāo)記陽性細(xì)胞比率來確定蛋白相對(duì)表達(dá)量。7.RNA轉(zhuǎn)染：根據(jù)Iipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作提示將目的miRNA以及無意義miRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。8.腺病毒感染：將pre-miR-143前體通過腺病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞以上調(diào)miR-143表達(dá)。9. MiRNA芯片：委托上海博奧生物集團(tuán)有限公司完成。10.雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)：利用雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-143對(duì)PD-L1的3'UTR報(bào)告基因活性影響。11.裸鼠荷瘤：EL4細(xì)胞消化收集后配成107個(gè)/m1的濃度,將0.2m1細(xì)胞懸液注射到裸鼠頸背部皮下。12.統(tǒng)計(jì)方法：兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間采用t檢驗(yàn),多組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間采用方差分析,p0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.MiR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中發(fā)揮抑制作用1.1通過miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中miR-143的拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常胸腺組織；在對(duì)15對(duì)輻射誘導(dǎo)胸腺瘤與正常胸腺組織樣本通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中,也同樣發(fā)現(xiàn)輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤中miR-143的表達(dá)明顯低于正常小鼠胸腺組織。1.2通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染以及腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-143表達(dá)可以顯著抑制NIH3T3以及EL4細(xì)胞的增殖,而且miR-143表達(dá)上調(diào)的越厲害對(duì)EL4細(xì)胞增殖的抑制作用就越強(qiáng)烈。1.3無論是NIH3T3細(xì)胞還是EL4細(xì)胞,通過miR-143的反義抑制劑(miR-143ASO)下調(diào)miR-143后,通過MTT法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-143的表達(dá)能夠顯著降低細(xì)胞的增殖活性。1.4在EL4細(xì)胞中,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染以及腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-143表達(dá)可以增加細(xì)胞的凋亡,且細(xì)胞凋亡水平隨著miR-143表達(dá)的上調(diào)程度越大而增加越多；通過miR-143 ASO下調(diào)NIH3T3細(xì)胞中miR-143表達(dá)可以顯著抑制其凋亡。1.5將采用腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-143表達(dá)的EL4細(xì)胞和普通EL4細(xì)胞注射到裸鼠背頸部皮下,通過觀察30天內(nèi)裸鼠背頸部腫瘤生成率,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-143的EL4細(xì)胞在荷瘤小鼠的成瘤率顯著降低,并且腫瘤體積也明顯要小。2.MiR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用于PD-L1抑制輻射誘導(dǎo)胸腺瘤的發(fā)生發(fā)展2.1雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果提示：在PD-L1的3'UTR野生型組,上調(diào)miR-143的表達(dá)可以顯著抑制PD-L1的表達(dá)；而在PD-L1的3'UTR突變體組,miR-143表達(dá)的上調(diào)與PD-L1的表達(dá)變化關(guān)系不明顯,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而通過抗體標(biāo)記后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度的結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-143可以顯著降低PD-L1的表達(dá)水平。這說明miR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用PD-L1。2.2上調(diào)miR-143和PD-L1表達(dá)的EL4細(xì)胞能夠逆轉(zhuǎn)僅上調(diào)miR-143表達(dá)的EL4細(xì)胞中由于miR-143上調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,同時(shí)還能夠提高細(xì)胞的增殖與活性,Rescue實(shí)驗(yàn)結(jié)果從另一方面證實(shí)了在電離輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中PD-L1確實(shí)是miR-143的作用靶蛋白。3.電離輻射能夠誘導(dǎo)正常胸腺組織中PD-L1高表達(dá)且在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中miR-143與PD-L1表達(dá)負(fù)相關(guān)3.1 BALB/c小鼠8Gy照后0h、12h、24h、48h以及空白對(duì)照組胸腺組織研磨成單細(xì)胞懸液,抗體標(biāo)記后流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-L1表達(dá)變化,照后0-24h,PD-L1表達(dá)迅速增加,PD-L1表達(dá)增加與時(shí)間延長(zhǎng)近似成線性正相關(guān),24h之后,PD-L1表達(dá)不再升高達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期；BALB/c小鼠OGy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy組照后24h,PD-L1表達(dá)升高先快后慢,整體近似成線性增加。這說明輻射能夠誘導(dǎo)正常小鼠胸腺組織PD-L1表達(dá)上調(diào)且具有一定的照后時(shí)間和照射劑量依賴性。3.2輻射誘導(dǎo)胸腺瘤與正常胸腺組織研磨成單細(xì)胞懸液,抗體標(biāo)記后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度來確定PD-L1表達(dá),輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤的PD-L1表達(dá)比正常小鼠胸腺組織的明顯要高。3.3輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中PD-L1蛋白表達(dá)顯著升高而PD-L1的mRNA變化不明顯,miR-143與PD-L1蛋白的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)。并且PD-L1蛋白表達(dá)與PD-L1的mRNA表達(dá)的比值與miR-143的表達(dá)也成負(fù)相關(guān)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)討論：隨著人類對(duì)核能的利用越來越廣泛,民眾受到輻射致癌的危險(xiǎn)也越來越高,但是迄今為止,對(duì)輻射致癌機(jī)理的研究還沒有一個(gè)明確的解釋,對(duì)輻射致癌的防治也尚無比較好的治療的途徑。近年來隨著腫瘤免疫治療研究的興起,負(fù)性共刺激因子PD-L1因?yàn)橥ㄟ^調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展成為研究熱點(diǎn),而大量miRNA基因組定位于和腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn),這說明miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系極為密切。正是基于此,本課題期望從miR-143通過調(diào)節(jié)PD-L1進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫從而在輻射致癌中發(fā)揮作用來初步探討PD-L1在電離輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用及相關(guān)潛在的輻射致癌防治的可能途徑。本課題研究發(fā)現(xiàn)miR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中低表達(dá),它對(duì)細(xì)胞能夠抑增殖和促凋亡,并且miR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用于PD-L1。在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中它還與PD-L1蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān),并且通過上調(diào)miR-143表達(dá)抑制PD-L1的表達(dá),進(jìn)而能夠降低細(xì)胞增殖與活性、提高細(xì)胞凋亡率,發(fā)揮輻射致癌的防治作用。另一方面輻射能夠誘導(dǎo)機(jī)體PD-L1表達(dá)升高,在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤等一系列腫瘤中PD-L1也是高表達(dá),而PD-L1在腫瘤的免疫逃逸機(jī)制做發(fā)揮重要作用,這也提示我們通過抑制PD-L1的表達(dá)可能能夠起到防治輻射致癌的作用�？偠灾�,通過電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞下調(diào)miR-143來上調(diào)PD-L1表達(dá)可能是促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)胸腺瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)作用途徑,而通過反向干預(yù)這一調(diào)節(jié)過程就有可能起到防治輻射致癌的作用。
【關(guān)鍵詞】：PD-L1 miR-143 輻射致癌 腫瘤防治 輻射誘導(dǎo)胸腺瘤
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R736.3;R594.8
【目錄】：

• 摘要5-11
• Abstract11-18
• 縮略詞18-19
• 前言19-21
• 第一部分：MiR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用21-30
• 一、實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 二、實(shí)驗(yàn)方法22-23
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-29
• 四、討論29-30
• 第二部分：MiR-143在輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中的作用機(jī)制30-36
• 一、實(shí)驗(yàn)材料30-31
• 二、實(shí)驗(yàn)方法31-32
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-35
• 四、討論35-36
• 第三部分：輻射誘導(dǎo)胸腺瘤中PD-L1表達(dá)及與miR-143表達(dá)的關(guān)系36-44
• 一、實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 二、實(shí)驗(yàn)方法37
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-43
• 四、討論43-44
• 全文總結(jié)44-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 綜述53-63
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 文章發(fā)表63-64
• 致謝64

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號(hào)：666170