本文關鍵詞：MiR-143靶向PD-L1在電離輻射誘導胸腺瘤中的作用及機制研究

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【摘要】：隨著核能在軍事武器裝各領域、工業(yè)領域、醫(yī)療領域以及科學研究等領域的應用不斷普及和擴大,核能就像一把雙刃劍,一方面能夠極大造福我們人類,而另一方面則給我們帶來了日益嚴重的電離輻射危害。而作為電離輻射最重要的遠后效應之一,輻射致癌的發(fā)生率隨著民眾接觸到電離輻射的機會越來越多而不斷增加,已經(jīng)受到了輻射相關從業(yè)人員以及普通民眾的廣泛關注。除了輻射致癌能直接對人員健康造成巨大的傷害,還由于輻射致癌的潛伏期長以及電離輻射看不見摸不著的特點會對民眾造成巨大的心理恐慌,因此輻射致癌已經(jīng)引起研究人員廣泛的關注并開展了多方面的研究。MicroRNA(縮寫為miRNA)又稱小分子RNA或者微小RNA,是真核生物內的一類內源性的單鏈RNA,一般由21-25個核苷酸構成。首先由DNA轉錄形成長度300-1000個堿基的pri-miRNA(primary transcript),經(jīng)過一次加工后成為長度70-90個堿基的miRNA前體pre-miRNA,再經(jīng)過Dicer酶切成為長度21-25個堿基的成熟miRNA。作為非編碼RNA,miRNA不是像別的mRNA那樣通過中心法則中的翻譯過程合成蛋白質來發(fā)揮其生物學功能,而是與靶基因轉錄成的mRNA 3'端非編碼區(qū)通過堿基互補配對來相互結合,從而抑制靶基因翻譯成蛋白起到沉默靶基因表達的作用。自1993年最先在線蟲中發(fā)現(xiàn)了miRNA,隨后在病毒、植物以及動物等上面發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計的miRNA,而每個miRNA又可以作用于幾十甚至上百個靶基因,因此,miRNA雖小,但它調控的范圍非常廣,在正常的基因表達過程中發(fā)揮了極其重要的調節(jié)作用。MiRNA的高度保守性決定了miRNA在調控生物體最基本最重要的生物學過程中發(fā)揮重要作用。研究證實miRNA在細胞增殖、凋亡、分化、發(fā)育、免疫、腫瘤發(fā)生等一系列極為重要的生物學過程中發(fā)揮了不可或缺的調節(jié)作用。最新研究發(fā)現(xiàn),在多種癌癥中許多miRNA分別出現(xiàn)了明顯的高表達或者低表達,這其中約有一半得到注解的miRNA基因組定位于和腫瘤相關的脆性位點,這說明niRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關系。根據(jù)miRNA對腫瘤的調控作用,按功能可將miRNA分為癌基因樣miRNA (OncomiR),如miR-21,以及抑癌樣基因(Anti-oncomiR),如let-7。其中癌基因樣miRNA的高表達或者抑癌基因樣miRNA的低表達都會促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,反過來,癌基因樣miRNA的低表達或者抑癌基因樣miRNA的高表達則會抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本教研室的課題組近年來一直從事輻射致癌方面的研究,已經(jīng)通過多次分開低劑量照射誘導小鼠胸腺瘤成功建立了小鼠的輻射致癌模型,并對輻射致癌過程中與正常組織相比表達差異比較大的蛋白、基因和miRNA進行了初步的研究。篩選出了一些表達差異比較明顯的miRNA進行輻射致癌相關的后續(xù)研究,miR-143就是其中之一。MiR-143最早于2002年由Lagos-Quintana等從小鼠身上首次發(fā)現(xiàn),人的miR-143位于5號染色體上33號位點。miR-143表達高度保守,已知的miR-143的靶基因有Klf4、Elk1、ADD3等,miR-143主要與心臟發(fā)育和癌癥相關,研究發(fā)現(xiàn)miR-143屬于抑癌基因樣miRNA,它在胰腺癌、白血病、淋巴癌、骨肉瘤、肺癌、膀胱癌等細胞系中均表達明顯下調。目前對輻射致癌的分子機制研究還多停留在單個信號通路上,還不夠系統(tǒng),離徹底揭示輻射致癌分子機制還有很長的路要走。對于niRNA在輻射致癌中的作用以及如何利用miRNA用于腫瘤的防治方面的研究還有待進一步的擴展和深入。本課題組通過miRNA芯片結果結合生物信息學預測在輻射誘導胸腺瘤中miR-143作用的靶蛋白很可能是PD-L1。PD-L1 (Programmed cell death ligand 1)是程序性細胞死亡受體1(Programmed cell death 1, PD-1)的配體之一,亦稱CD274 (Cluster of differentiation 274)或者B7-H1 (B7 homolog 1)。1999年中國科學家陳列平率先發(fā)現(xiàn)了PD-L1,隨后Dong等首次采用cDNA表達序列標簽克隆出人B7-H1分子,而Freeman等發(fā)現(xiàn)它能夠直接結合PD-1,然后發(fā)揮抑制T細胞活化的功能,遂將它稱為PD-L1。作為B7免疫球蛋白超家族的第三個成員,它是一個分子量在40kD左右由290個氨基酸構成的Ⅰ型跨膜糖蛋白,與B7-DC(PD-L2, PD-1的另一個配體)、B7-1、B7-2以及ICOS的氨基酸同源性分別為40%、21%、20%和23%。人類的PD-L1基因位于9號染色體,而小鼠的則位于19號染色體,但它們相同的結構是都由短而帶電的胞漿區(qū)、疏水結構的跨膜區(qū)以及包含一個免疫球蛋白V和一個免疫球蛋白C結構域的胞外區(qū)三部分構成。PD-L1的mRNA主要以4.2kb的形式存在,但也同時還以1.8kb、3.7kb以及7.2kb的不同轉錄形式存在。PD-L1廣泛表達于正常組織中的APC、T/B淋巴細胞、DC、巨噬細胞、多種間質細胞等淋巴組織相關細胞,它主要通過調節(jié)機體免疫細胞的活性來抑制機體的免疫反應性。PD-L1還在大多數(shù)的腫瘤組織中表達,而且是高表達,但在腫瘤旁邊的正常組織中卻是低表達,這提示我們它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用�；赑D-L1通過調節(jié)機體免疫反應性在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,而miRNA與多種癌癥相關,并且在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調節(jié)作用,本文將miRNA與免疫負性共刺激分子PD-L1相結合,從利用miRNA調控PD-L1的表達進而調節(jié)機體免疫的角度來闡明PD-L1在輻射致癌中的作用,并初步探索通過調控PD-L1來防治輻射致癌的作用及其作用機制。研究內容：1.MiR-143在輻射誘導胸腺瘤中的作用：①觀察正常小鼠胸腺組織與輻射誘導小鼠胸腺瘤組織中miR-143的表達差異；②分別觀察上調、下調miR-143對細胞增殖與凋亡的影響；③觀察EL4細胞中上調miR-143表達對細胞裸鼠荷瘤成功率及腫瘤生長的影響。2.MiR-143在輻射誘導胸腺瘤中的作用機制：①預測miR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用PD-L1影響輻射誘導胸腺瘤的發(fā)生發(fā)展；②通過Rescue實驗進一步驗證PD-L1確實是miR-143的靶蛋白。3.電離輻射對PD-L1表達的影響以及輻射誘導胸腺瘤中miR-143與PD-L1表達之間的關系：①觀察同一劑量照后不同時間以及不同劑量照后同一時間小鼠胸腺組織PD-L1表達變化；②觀察正常小鼠胸腺組織和輻射誘導胸腺瘤小鼠胸腺組織中PD-L1表達的差異；③觀察輻射誘導胸腺瘤小鼠胸腺組織中miR-143與PD-L1表達之間的關系。實驗方法：1.γ射線照射條件：采用實驗用鈷-60γ射線進行照射,劑量率為每分鐘0.58Gy。2.細胞培養(yǎng)：小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3細胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清以及每毫升培養(yǎng)基各加入100單位的青霉素和鏈霉素；小鼠淋巴瘤細胞EL4細胞培養(yǎng)條件為RMPI-1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清以及每毫升培養(yǎng)基各加入100單位的青霉素和鏈霉素,于細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。3.實時熒光定量PCR測定：采用SYBRGreen Ⅰ法,利用羅氏實時熒光定量PCR儀通過產(chǎn)物溶解曲線來進行相對定量。4.細胞活力檢測：MTT法檢測細胞的光密度值來確定細胞的增殖與活性。5.細胞凋亡檢測：采用Annexin Ⅴ/PI雙染凋亡檢測試劑盒通過流式細胞儀來檢測細胞凋亡比率。6.蛋白表達檢測：通過與特異性抗體結合利用流式細胞儀檢測細胞平均熒光強度或者抗體標記陽性細胞比率來確定蛋白相對表達量。7.RNA轉染：根據(jù)Iipo2000轉染試劑盒操作提示將目的miRNA以及無意義miRNA轉入細胞。8.腺病毒感染：將pre-miR-143前體通過腺病毒轉染目的細胞以上調miR-143表達。9. MiRNA芯片：委托上海博奧生物集團有限公司完成。10.雙熒光報告基因檢測：利用雙熒光報告基因檢測試劑盒檢測miR-143對PD-L1的3'UTR報告基因活性影響。11.裸鼠荷瘤：EL4細胞消化收集后配成107個/m1的濃度,將0.2m1細胞懸液注射到裸鼠頸背部皮下。12.統(tǒng)計方法：兩組實驗結果之間采用t檢驗,多組實驗結果之間采用方差分析,p0.05表示有統(tǒng)計學差異。實驗結果：1.MiR-143在輻射誘導胸腺瘤中發(fā)揮抑制作用1.1通過miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)輻射誘導胸腺瘤中miR-143的拷貝數(shù)遠遠低于正常胸腺組織；在對15對輻射誘導胸腺瘤與正常胸腺組織樣本通過實時熒光定量PCR檢測中,也同樣發(fā)現(xiàn)輻射誘導小鼠胸腺瘤中miR-143的表達明顯低于正常小鼠胸腺組織。1.2通過脂質體轉染以及腺病毒轉染上調miR-143表達可以顯著抑制NIH3T3以及EL4細胞的增殖,而且miR-143表達上調的越厲害對EL4細胞增殖的抑制作用就越強烈。1.3無論是NIH3T3細胞還是EL4細胞,通過miR-143的反義抑制劑(miR-143ASO)下調miR-143后,通過MTT法檢測結果發(fā)現(xiàn)下調miR-143的表達能夠顯著降低細胞的增殖活性。1.4在EL4細胞中,通過脂質體轉染以及腺病毒轉染上調miR-143表達可以增加細胞的凋亡,且細胞凋亡水平隨著miR-143表達的上調程度越大而增加越多；通過miR-143 ASO下調NIH3T3細胞中miR-143表達可以顯著抑制其凋亡。1.5將采用腺病毒轉染上調miR-143表達的EL4細胞和普通EL4細胞注射到裸鼠背頸部皮下,通過觀察30天內裸鼠背頸部腫瘤生成率,發(fā)現(xiàn)過表達miR-143的EL4細胞在荷瘤小鼠的成瘤率顯著降低,并且腫瘤體積也明顯要小。2.MiR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用于PD-L1抑制輻射誘導胸腺瘤的發(fā)生發(fā)展2.1雙熒光報告基因檢測結果提示：在PD-L1的3'UTR野生型組,上調miR-143的表達可以顯著抑制PD-L1的表達；而在PD-L1的3'UTR突變體組,miR-143表達的上調與PD-L1的表達變化關系不明顯,沒有統(tǒng)計學意義。而通過抗體標記后利用流式細胞儀檢測平均熒光強度的結果發(fā)現(xiàn),過表達miR-143可以顯著降低PD-L1的表達水平。這說明miR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用PD-L1。2.2上調miR-143和PD-L1表達的EL4細胞能夠逆轉僅上調miR-143表達的EL4細胞中由于miR-143上調導致的細胞凋亡,同時還能夠提高細胞的增殖與活性,Rescue實驗結果從另一方面證實了在電離輻射誘導胸腺瘤中PD-L1確實是miR-143的作用靶蛋白。3.電離輻射能夠誘導正常胸腺組織中PD-L1高表達且在輻射誘導胸腺瘤中miR-143與PD-L1表達負相關3.1 BALB/c小鼠8Gy照后0h、12h、24h、48h以及空白對照組胸腺組織研磨成單細胞懸液,抗體標記后流式細胞儀檢測PD-L1表達變化,照后0-24h,PD-L1表達迅速增加,PD-L1表達增加與時間延長近似成線性正相關,24h之后,PD-L1表達不再升高達到一個平臺期；BALB/c小鼠OGy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy組照后24h,PD-L1表達升高先快后慢,整體近似成線性增加。這說明輻射能夠誘導正常小鼠胸腺組織PD-L1表達上調且具有一定的照后時間和照射劑量依賴性。3.2輻射誘導胸腺瘤與正常胸腺組織研磨成單細胞懸液,抗體標記后通過流式細胞儀檢測平均熒光強度來確定PD-L1表達,輻射誘導小鼠胸腺瘤的PD-L1表達比正常小鼠胸腺組織的明顯要高。3.3輻射誘導胸腺瘤中PD-L1蛋白表達顯著升高而PD-L1的mRNA變化不明顯,miR-143與PD-L1蛋白的表達水平負相關。并且PD-L1蛋白表達與PD-L1的mRNA表達的比值與miR-143的表達也成負相關關系。實驗討論：隨著人類對核能的利用越來越廣泛,民眾受到輻射致癌的危險也越來越高,但是迄今為止,對輻射致癌機理的研究還沒有一個明確的解釋,對輻射致癌的防治也尚無比較好的治療的途徑。近年來隨著腫瘤免疫治療研究的興起,負性共刺激因子PD-L1因為通過調節(jié)機體的免疫平衡影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展成為研究熱點,而大量miRNA基因組定位于和腫瘤相關的脆性位點,這說明miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系極為密切。正是基于此,本課題期望從miR-143通過調節(jié)PD-L1進而調節(jié)機體免疫從而在輻射致癌中發(fā)揮作用來初步探討PD-L1在電離輻射誘導胸腺瘤中的作用及相關潛在的輻射致癌防治的可能途徑。本課題研究發(fā)現(xiàn)miR-143在輻射誘導胸腺瘤中低表達,它對細胞能夠抑增殖和促凋亡,并且miR-143以3'UTR依賴的方式靶向作用于PD-L1。在輻射誘導胸腺瘤中它還與PD-L1蛋白表達負相關,并且通過上調miR-143表達抑制PD-L1的表達,進而能夠降低細胞增殖與活性、提高細胞凋亡率,發(fā)揮輻射致癌的防治作用。另一方面輻射能夠誘導機體PD-L1表達升高,在輻射誘導胸腺瘤等一系列腫瘤中PD-L1也是高表達,而PD-L1在腫瘤的免疫逃逸機制做發(fā)揮重要作用,這也提示我們通過抑制PD-L1的表達可能能夠起到防治輻射致癌的作用。總而言之,通過電離輻射誘導細胞下調miR-143來上調PD-L1表達可能是促進電離輻射誘導胸腺瘤發(fā)生發(fā)展的一個作用途徑,而通過反向干預這一調節(jié)過程就有可能起到防治輻射致癌的作用。
【關鍵詞】：PD-L1 miR-143 輻射致癌 腫瘤防治 輻射誘導胸腺瘤
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R736.3;R594.8
【目錄】：

• 摘要5-11
• Abstract11-18
• 縮略詞18-19
• 前言19-21
• 第一部分：MiR-143在輻射誘導胸腺瘤中的作用21-30
• 一、實驗材料21-22
• 二、實驗方法22-23
• 三、實驗結果23-29
• 四、討論29-30
• 第二部分：MiR-143在輻射誘導胸腺瘤中的作用機制30-36
• 一、實驗材料30-31
• 二、實驗方法31-32
• 三、實驗結果32-35
• 四、討論35-36
• 第三部分：輻射誘導胸腺瘤中PD-L1表達及與miR-143表達的關系36-44
• 一、實驗材料36-37
• 二、實驗方法37
• 三、實驗結果37-43
• 四、討論43-44
• 全文總結44-47
• 參考文獻47-53
• 綜述53-63
• 參考文獻57-63
• 文章發(fā)表63-64
• 致謝64

【共引文獻】

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本文編號：666170