目的構(gòu)建并鑒定野生型PIRES2-EGFP-eIF4E3(eIF4E3)、突變體PIRES2-EGFP-eIF4E3 C69a (e IF4E3C69a)、突變體PIRES2-EGFP-eIF4E3 w86a (e IF4E3 w86a)真核過表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究基因eIF4E3的功能奠定基礎(chǔ)。方法通過PCR在人細(xì)胞cDNA庫中擴(kuò)增eIF4E3,人工化學(xué)合成突變體e IF4E3C69a和eIF4E3w86a。將目的片段和空載質(zhì)粒PIRES2-EGFP分別雙酶切后進(jìn)行連接,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,挑取單克隆,搖菌擴(kuò)增,提取質(zhì)粒,雙酶切電泳、菌液及其質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、DNA測序鑒定。結(jié)果 PCR結(jié)果顯示插入片段大小正確,測序結(jié)果通過Blast比對NIH基因庫的eIF4E3基因序列顯示e IF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3w86a序列準(zhǔn)確且編碼框架正確插入PIRES2-EGFP中。結(jié)論成功構(gòu)建eIF4E3、eIF4E3C69a、e IF4E3W86a真核過表達(dá)載體。

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圖1eIF4E3野生型和突變體基因PCR擴(kuò)增電泳圖

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，從擴(kuò)增圖可以看到3條大小約為675bp的條帶，與預(yù)期的野生型（eIF4E3）和突變型（C69a、W86a）基因大小一致（圖1）。2.2重組質(zhì)粒PIRES2-EGFP-eIF4E3、PIRES2-EGFP-C69a、PIRES2-EGFP-W8....

圖2eIF4E3野生型和突變體重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖

經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析以后回收得到的PCR產(chǎn)物與PIRES2-EGFP空載體進(jìn)行雙酶切后，用連接酶進(jìn)行連接用含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行鋪板長菌，挑取2～3個單克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒最后進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定。雙酶切后可以得到大約675bp的片段（圖2），進(jìn)一步進(jìn)行菌液及其質(zhì)粒的....

圖3eIF4E3野生型和突變體菌液及質(zhì)粒PCR電泳圖

圖2eIF4E3野生型和突變體重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖2.3重組質(zhì)粒測序結(jié)果

圖4eIF4E3野生型和突變體質(zhì)粒測序圖

eIF4E3是最近年新發(fā)現(xiàn)的一種潛在的抑癌基因。本實驗中我們成功的將eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因鏈接到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中。我們選用的pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體容易進(jìn)入細(xì)胞，容量比較大，易于檢測，在臨床實驗中應(yīng)用比較廣泛....

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