本文關鍵詞：茵陳蒿湯對膽汁性肝纖維化大鼠模型肝卵圓細胞的影響

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【摘要】：一、背景和目的 肝纖維化是由多種致病因子所致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生,是一動態(tài)發(fā)展過程,是各種肝臟疾病最終發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)病理階段,具有可逆性。在肝膽外科臨床中,膽管梗阻、膽汁淤積是比較常見的病理環(huán)境,較長時間的梗阻,可誘發(fā)永久性肝損害,甚至發(fā)展成肝纖維化及膽汁性肝硬化,嚴重危害患者的生活質(zhì)量及生存率。近年來雖然對膽汁淤積性肝纖維化發(fā)病機制的研究有了進一步的認識,但仍是臨床治療的難題。部分患者即使接受了成功的膽汁引流手術,黃疸消退緩慢,肝功能恢復不良,術后并發(fā)癥發(fā)生率高,使得患者平均住院天數(shù)延長,治療費用增加,心理負擔加重,因此,早期預防和阻斷肝進行性纖維化是治療的關鍵所在。 既往研究發(fā)現(xiàn)各種慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展與類似于卵圓細胞的肝前體細胞的活化有密切的關系。這種肝前體細胞主要定位于匯管區(qū)、纖維間隔、匯管區(qū)旁肝實質(zhì)、假小葉及炎癥邊界,具有增殖分化為成熟肝實質(zhì)細胞和膽管上皮細胞的雙潛能。隨著大鼠肝卵圓細胞特異性標記物0V-6的發(fā)現(xiàn),卵圓細胞相關研究成為了熱點。特別是肝卵圓細胞參與肝臟的損傷修復、肝臟纖維化的相關研究。這些理論為研究肝臟損傷的保護、治療及肝纖維化的形成機制提供了最新途徑。 膽汁淤積性肝纖維化屬于中醫(yī)“黃疸”的范疇。茵陳蒿湯出自東漢·張仲景《傷寒論》,由茵陳、梔子和大黃組成,具有清熱利濕退黃之功效,是治療濕熱黃疸的主方�，F(xiàn)代研究表明,茵陳蒿湯具有利膽、保肝、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒等作用。近年來對茵陳蒿湯抗肝纖維化機制的相關研究屢見不鮮。 因此,本研究的主要目的是通過結(jié)扎Wistar大鼠膽總管,模擬膽管梗阻膽汁淤積肝纖維化病理狀態(tài),采用免疫組化、PCR技術,觀察茵陳蒿湯對實驗性大鼠肝纖維化肝卵圓細胞增殖的影響和肝星狀細胞激活的調(diào)節(jié),探討茵陳蒿湯在保肝和抗肝纖維化中的作用,為臨床治療膽汁淤積性肝纖維化提供一定的理論依據(jù)。 二、材料與方法 雄性Wistar大鼠40只隨機分成四組,即假手術對照組(10只)、膽總管結(jié)扎組(10只)、再通組(10只)和再通+中藥干預組(10只)。假手術對照組僅作膽總管分離,不作膽總管結(jié)扎,其余各組采用膽總管結(jié)扎制備膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型,膽總管結(jié)扎術后第7天、第10天分別行膽道再通,再通術后第1天同時分別給予中藥灌胃和等量生理鹽水灌胃3天。各組大鼠術后相同條件下飼養(yǎng)。假手術對照組和膽總管結(jié)扎組分別于術后第7天、第10天兩個時相點處死大鼠,再通組和再通+中藥干預組分別于再通術后第3天處死大鼠,每組各處死5只。肝臟標本：取肝右葉應用10%福爾馬林固定留作免疫組化；取肝左葉-80℃凍存留作RT-PCR檢測。 1、通過肉眼及HE染色分別觀察膽管梗阻不同時相點肝組織形態(tài)學改變。 2、通過免疫組化,OV-6標記肝卵圓細胞,動態(tài)觀察不同時相點肝卵圓細胞的數(shù)目及分布范圍。 3、通過RT-PCR檢測各目的基因mRNA的表達：α-平滑肌動蛋白(α-SMA)及I型膠原蛋白(COL Ⅰ),動態(tài)觀察不同時相點各基因的表達情況。 三、結(jié)果 1、大體結(jié)果 (1)假手術對照組：肝臟標本各肝葉色澤紅潤,表面光滑。 (2)膽總管結(jié)扎組：Wistar大鼠膽管結(jié)扎后可見肝臟逐漸黃染并腫脹,部分質(zhì)地變硬,肝臟淤血、水腫,10%福爾馬林固定大鼠肝葉標本后,可見表面粗糙,顏色灰白等肝組織早期纖維化的表現(xiàn),并隨著梗阻時間的延長而加重。 (3)再通組：肝臟淤膽腫脹程度較再通組有所減輕。 (4)再通+中藥干預組：肝臟病變與再通組相比肉眼無明顯改善。 2、HE染色結(jié)果 (1)假手術對照組：未見炎性細胞浸潤、亦未見肝細胞變性、壞死等。 (2)膽總管結(jié)扎組：膽管結(jié)扎術后第7天肝小葉結(jié)構完整,可見炎性細胞浸潤,肝細胞腫脹,少數(shù)出現(xiàn)變性壞死,重者見片狀出血和壞死,肝組織匯管區(qū)可見膽管增生和纖維細胞增生性改變；術后第10天肝小葉結(jié)構受到破壞,可見肝細胞空泡變性及壞死,纖維化程度逐漸加重。 (3)再通組：膽道再通術后肝細胞變性、壞死、腫脹程度減輕,肝組織仍可見炎性改變及部分纖維化。 (4)再通+中藥干預組：與再通組相比,該組大鼠肝臟病變情況有所減輕。 3、免疫組化結(jié)果 OV-6陽性細胞表達部位主要分布于匯管區(qū)膽管、纖維間隔、肝間質(zhì)新增生膽管及無管腔的小膽管細胞胞漿中。OV-6免疫組化陽性染色的細胞數(shù)目及分布范圍隨著梗阻時間的延長而增加。應用IDA-2000高清晰度數(shù)碼顯微圖象分析系統(tǒng)對陽性細胞著色面積進行統(tǒng)計分析,假手術對照組在各時相點有極少量陽性表達,膽總管結(jié)扎組OV-6陽性細胞表達面積在造模后第7天、第10天均較假手術對照組相應時相點增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與膽總管結(jié)扎組比較,造模7天后再通組OV-6陽性細胞表達面積有所增加,造模10天后再通組OV-6陽性細胞表達面積亦有所增加,但差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。再通+中藥干預組OV-6陽性細胞表達面積在相應時相點均較再通組增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4、RT-PCR結(jié)果 應用2-ΔΔCt法分析基因相對表達量。結(jié)果如下：第7天膽總管結(jié)扎組α-SMA mRNA的相對表達量與假手術對照組相比升高了6.72倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),再通組α-SMA mRNA的相對表達量比假手術對照組升高了2.59倍,而再通+中藥干預組α-SMA mRNA的相對表達量只比假手術對照組升高了1.38倍,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)：與假手術對照組相比,第10天膽總管結(jié)扎組α-SMA mRNA (?)的相對表達量顯著增高到13.38倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而再通組α-SMA mRNA表達升高了5.94倍,再通+中藥干預組α-SMA mRNA的相對表達量只升高了1.56倍,差異不顯著(P0.05),再通+中藥干預組第7天與再通組相應時相點比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05),再通+中藥干預組第10天與再通組相應時相點比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而再通+中藥干預組與膽總管結(jié)扎組各時相點相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。膽總管結(jié)扎組COL1mRNA表達在第7天較假手術對照組升高了9.94倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),第10天時進一步升高至10.71倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);再通組COL1mRNA表達在第7天較對假手術對照組升高了3.95倍,第10天升高至5.41倍,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05);再通+中藥干預組在第7天和第10天與假手術對照組相比改變不明顯,再通+中藥干預組第7天與再通組相應時相點比較,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05),再通+中藥干預組第10天與再通組相應時相點比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而再通+中藥干預組與膽總管結(jié)扎組各時相點相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)�？梢�,α-SMA和COL1基因相對表達量隨著膽管結(jié)扎天數(shù)的增加而逐漸升高；再通術后早期再通較晚期再通α-SMA和COL1基因相對表達量減少；α-SMA和COL1基因表達變化趨勢在各組中具有一致性；茵陳蒿湯可以使膽汁性肝纖維化大鼠模型α-SMA mRNA和COL1mRNA表達呈明顯下降的趨勢。 四、結(jié)論 1、本實驗通過結(jié)扎肝外膽管造成膽管梗阻,成功復制了膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型,觀察了不同時相點肝臟的病理學改變,證實隨著膽管梗阻時間的延長,其肝臟膽汁淤積性、纖維化程度呈進行性加重趨勢,茵陳蒿湯在減輕肝纖維化大鼠的肝臟病理損傷方面優(yōu)于單純再通,可以促進再通術后肝臟的病理和功能改善。 2、本實驗通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯可以通過上調(diào)膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型肝組織中OV-6的表達,促進肝卵圓細胞的增殖,改善肝纖維化的進程。 3、本實驗通過RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯可以抑制肝纖維化大鼠肝組織中α-SMA和COL1基因的表達,可能在一定程度上減緩肝纖維化的程度。 4、本實驗研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化的形成是一個多因素參與的復雜過程,茵陳蒿湯具有上調(diào)肝卵圓細胞OV-6的表達,促使膠原蛋白沉積降解以及肝星狀細胞凋亡的作用,這可能是茵陳蒿湯減緩肝纖維化進程的機制之一。
【關鍵詞】：茵陳蒿湯 膽管結(jié)扎肝纖維化 卵圓細胞 肝星狀細胞 α-平滑肌動蛋白 Ⅰ型膠原蛋白
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R285.5;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 目錄13-14
• 縮略語/符號說明14-15
• 前言15-17
• 研究現(xiàn)狀、成果15-16
• 研究目的、方法16-17
• 1.1 對象和方法17-23
• 1.1.1 實驗動物17
• 1.1.2 主要設備材料、試劑及中藥17-18
• 1.1.3 實驗動物分組及模型制作18
• 1.1.4 標本采集及保存18
• 1.1.5 觀察指標和方法18-23
• 1.1.6 統(tǒng)計學分析23
• 1.2 結(jié)果23-34
• 1.2.1 大體形態(tài)學結(jié)果23
• 1.2.2 HE染色結(jié)果23-25
• 1.2.3 免疫組化結(jié)果25-27
• 1.2.4 RT-PCR結(jié)果27-34
• 1.3 討論34-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-42
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明42-43
• 附圖43-45
• 綜述45-55
• 綜述參考文獻51-55
• 致謝55

【參考文獻】

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本文編號：998403