本文關(guān)鍵詞：大竹蟶肽聚糖識別蛋白的免疫防御功能研究

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【摘要】：大竹蟶（Solen grandis）屬瓣鰓綱，廣泛分布于中國沿海各地。因其個(gè)體大、出肉率高、味道鮮美、營養(yǎng)豐富和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，大竹蟶已成為我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)品種之一。與其它海洋無脊椎動(dòng)物相似，大竹蟶缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠先天性免疫系統(tǒng)抵御外界病原微生物的侵害。 肽聚糖識別蛋白是無脊椎動(dòng)物先天性免疫中重要的模式識別受體，能夠識別細(xì)菌的肽聚糖，，在病原識別和清除過程中發(fā)揮重要作用。到目前為止，對大竹蟶肽聚糖識別蛋白的研究非常有限，其抵御外來病原入侵的作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)合分子生物學(xué)和免疫生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，對大竹蟶肽聚糖識別蛋白介導(dǎo)的免疫識別和免疫應(yīng)答進(jìn)行研究，旨在深入了解大竹蟶的先天性免疫機(jī)制。 (一)序列分析 本研究獲得了大竹蟶肽聚糖識別蛋白SgPGRP-S1和SgPGRP-S2編碼基因的cDNA，其全長分別為1672和1285bp，各自編碼270和141個(gè)氨基酸。ExPASy預(yù)測兩個(gè)蛋白基因的理論等電點(diǎn)分別為7.82和5.46，分子量分別為28.4和14.7kDa。 同源性分析顯示SgPGRP-S1與SgPGRP-S2之間的相似度為51%，二者分別與光滑雙臍螺（ABO40829）和囊舌蟲（XP_002734591）的肽聚糖識別蛋白同源性最高，相似度分別為57%和55%。 多序列比對發(fā)現(xiàn)，SgPGRP-S1和SgPGRP-S2序列中均存在高度保守的Zn2+結(jié)合位點(diǎn)和酰胺酶催化位點(diǎn)，Zn2+結(jié)合位點(diǎn)分別為H135、H244和C252以及H115和C123，酰胺酶催化位點(diǎn)分別為H135，Y170，H244，T250和C252以及H115、T121和C123。 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹探討SgPGRP-S1和SgPGRP-S2與其它生物（牡蠣、櫛孔扇貝、海灣扇貝、果蠅和人）的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SgPGRP-S1和SgPGRP-S2與軟體動(dòng)物具有較高的同源性，與牡蠣的四種肽聚糖識別蛋白-S1S、-S1L、-S2，-S3聚合成支。 以上結(jié)果證明SgPGRP-S1和SgPGRP-S2是肽聚糖識別蛋白超家族的重要成員。 (二)熒光定量PCR檢測SgPGRP的轉(zhuǎn)錄規(guī)律 利用熒光定量PCR法檢測了SgPGRP-S1和SgPGRP-S2在健康大竹蟶組織中的轉(zhuǎn)錄規(guī)律，發(fā)現(xiàn)二者在所有檢測組織中都有表達(dá)。SgPGRP-S1在肌肉和肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次為鰓、外套膜、性腺，在血細(xì)胞中的表達(dá)量最低；SgPGRP-S2在鰓和外套膜中表達(dá)量較高，其次為血細(xì)胞和性腺，在肌肉中表達(dá)量最低。 此外，通過熒光定量PCR分析檢測LPS、PGN和glucan刺激后SgPGRP-S1在血細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律。經(jīng)PGN刺激后，SgPGRP-S1的表達(dá)量在3h顯著升高為對照的14.3倍；在6h達(dá)到最高，為對照組的7471倍；在12h和48h分別降低為對照組的13.9和5.7倍。經(jīng)glucan刺激后，SgPGRP-S1的表達(dá)量在12、24和48h分別顯著升高為對照組的22.4、11.9和89.7倍。而在LPS刺激后，SgPGRP-S1的表達(dá)量較對照組沒有顯著升高。 與SgPGRP-S1相比，SgPGRP-S2的表達(dá)量在LPS刺激后升高顯著，在6h升高為對照組的4.1倍，在24h和48h又顯著下調(diào)為0.1和0.3倍。經(jīng)PGN刺激后，SgPGRP-S2的表達(dá)趨勢與SgPGRP-S1相似，在6h達(dá)到高，在12h略降低后，24h升高為對照的4.4倍。在glucan刺激組，SgPGRP-S2的表達(dá)量在12h顯著升高為對照組的23.1倍，隨后恢復(fù)到原始水平。 (三) rSgPGRP-S1活性分析 PAMPs結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，SgPGRP-S1重組蛋白（rSgPGRP-S1）可以體外結(jié)合PGN，其結(jié)合能力隨其濃度增大而增強(qiáng)。rSgPGRP-S1對LPS和β-glucan均無結(jié)合能力。這些結(jié)果表明SgPGRP-S1主要介導(dǎo)大竹蟶對PGN的免疫識別作用。 rSgPGRP-S1具有廣譜凝菌活性，對大腸桿菌和鰻弧菌等革蘭氏陰性菌以及藤黃微球菌等革蘭氏陽性菌有凝集活性。該結(jié)果初步揭示了SgPGRP-S1作為模式識別受體，參與大竹蟶對抵御入侵病原微生物的免疫識別和免疫應(yīng)答反應(yīng)。 進(jìn)一步研究rSgPGRP-S1的酰胺酶活性，發(fā)現(xiàn)其具有依賴Zn2+的酰胺酶活性，通過水解N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的肽鍵而降解不溶性PGN。使用平板擴(kuò)散法檢測rSgPGRP-S1對革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)存在Zn2+時(shí)，rSgPGRP-S1對兩種細(xì)菌均具有顯著的抑制活性，產(chǎn)生明顯的抑菌圈。 同時(shí)檢測rSgPGRP-S1對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長曲線的影響，發(fā)現(xiàn)Zn2+存在時(shí)，rSgPGRP-S1在細(xì)菌生長對數(shù)期能夠明顯抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，而在生長穩(wěn)定期表現(xiàn)出顯著的殺菌活性。rSgPGRP-S1的這種抑菌殺菌活性可能與其酰胺酶活性有關(guān)。 綜上所述，本論文研究了大竹蟶肽聚糖識別蛋白作為模式識別受體，介導(dǎo)對PAMPs和病原微生物等的免疫識別作用和抵御病原微生物入侵等免疫應(yīng)答反應(yīng)的作用機(jī)制。研究結(jié)果為進(jìn)一步探討軟體動(dòng)物等無脊椎動(dòng)物的免疫應(yīng)答機(jī)制提供了理論依據(jù)，同時(shí)豐富和發(fā)展了海洋無脊椎動(dòng)物免疫防御機(jī)制的理論研究。
【關(guān)鍵詞】：大竹蟶 先天性免疫 肽聚糖識別蛋白 免疫識別 免疫應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-17
• 引言17-32
• 1 無脊椎動(dòng)物的先天性免疫系統(tǒng)17-24
• 1.1 非己的識別18-20
• 1.2 免疫信號的調(diào)整和放大20-21
• 1.3 病原體的清除21-24
• 2 肽聚糖識別蛋白概述24-28
• 2.1 肽聚糖識別蛋白的發(fā)現(xiàn)24-25
• 2.2 肽聚糖識別蛋白的結(jié)構(gòu)和分類25-26
• 2.3 肽聚糖識別蛋白的功能26-28
• 3 軟體動(dòng)物肽聚糖識別蛋白的研究進(jìn)展28-30
• 4 本研究的目的和意義30-32
• 第一章 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 序列全長合成及序列分析32-41
• 1 材料與方法32-34
• 1.1 試驗(yàn)樣品32
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器32
• 1.3 主要試劑32
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-39
• 2.1 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 的 cDNA 全長及氨基酸序列特征34-35
• 2.2 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 的多序列比對35-36
• 2.3 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 的系統(tǒng)進(jìn)化分析36-38
• 2.4 SgPGRP-S1 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測38-39
• 3 討論39-40
• 4 小結(jié)40-41
• 第二章 熒光定量 PCR 分析 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S1 的表達(dá)規(guī)律41-48
• 1 材料與方法41-44
• 1.1 試驗(yàn)樣品41
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器41
• 1.3 主要試劑41
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-46
• 2.1 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 在健康大竹蟶組織中的表達(dá)規(guī)律44
• 2.2 SgPGRP-S1 和 SgPGRP-S2 在微生物多糖刺激后的表達(dá)規(guī)律44-46
• 3 討論46
• 4 小結(jié)46-48
• 第三章 SgPGRP-S1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及活性分析48-68
• 1 材料與方法48-59
• 1.1 試驗(yàn)樣品48
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器48
• 1.3 主要試劑48-49
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法49-59
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-64
• 2.1 rSgPGRP-S1 蛋白的制備59-60
• 2.2 rSgPGRP-S1 多克隆抗體的制備60
• 2.3 rSgPGRP-S1 的 PAMPs 結(jié)合活性60-61
• 2.4 rSgPGRP-S1 的抑菌活性61-63
• 2.5 rSgPGRP-S1 的凝菌活性63-64
• 2.6 rSgPGRP-S1 的酰胺酶活性64
• 3 討論64-66
• 4 小結(jié)66-68
• 結(jié)論68-71
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 附錄77-81
• 已完成文章81-83
• 致謝83

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：976751