發(fā)布時(shí)間：2017-10-04 18:05

  本文關(guān)鍵詞：登革病毒包膜蛋白Ⅲ區(qū)單抗中和作用與作用機(jī)制研究以及登革病毒初次感染患者血清中和抗體反應(yīng)分析

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【摘要】：登革病毒(dengue virus, DENV)屬于病毒科(Flavivirade)黃病毒屬(Flavi virus),通過(guò)伊蚊等蟲(chóng)媒叮咬進(jìn)入人體。根據(jù)血清抗原性的不同分為四個(gè)血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4),人類感染其中的任何一型,癥狀輕者表現(xiàn)為無(wú)癥狀感染或發(fā)熱,重者可出現(xiàn)嚴(yán)重威脅生命的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)或登革休克綜合征(dengue shock Syndrome, DSS)。登革熱主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū),威脅著全世界2/5人口健康,但隨著國(guó)際交流日益頻繁、氣候變暖、城市化進(jìn)程加速等原因,登革病毒的流行范圍也隨之?dāng)U大。WHO數(shù)據(jù)表明,2000年后平均每年報(bào)道的感染人數(shù)達(dá)1億,每50萬(wàn)～100萬(wàn)例DHF/DSS中約有2.2萬(wàn)例患者死亡,主要為兒童。登革病毒已成為全球公共健康的威脅。 盡管登革病毒的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過(guò)60年,但迄今為止,尚未研發(fā)出安全有效的登革疫苗或特異性治療藥物,主要原因在于對(duì)DHF/DSS的發(fā)病機(jī)制了解不足。DENV初次感染后體內(nèi)能產(chǎn)生對(duì)四型病毒均有中和活性的抗體,但這一交叉保護(hù)作用僅能持續(xù)幾個(gè)月,隨后交叉反應(yīng)性抗體的中和活性下調(diào)。當(dāng)二次感染異型登革病毒時(shí),這些交叉反應(yīng)性或亞中和活性抗體能促進(jìn)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞而獲得大量復(fù)制,這一現(xiàn)象稱為抗體依賴的病毒感染增強(qiáng)效應(yīng)(antibody-dependent enhancement, ADE),研究表明,ADE是DHF和DSS發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。 登革病毒是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒,呈二十面體結(jié)構(gòu),病毒體的直徑大約為50nm,基因組大小為10.7kb,編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白(structural protein),分別是衣殼蛋白(capsid, C)、前膜/膜蛋白(premembrane/membrane, prM/M)和包膜蛋白(envelope, E),以及七種非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein, NS),分別是NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。其中,E蛋白是機(jī)能蛋白,它通過(guò)自身構(gòu)象的改變或表面單元的重排,參與病毒與細(xì)胞吸附、病毒進(jìn)入細(xì)胞、細(xì)胞膜融合以及病毒組裝等病毒生命周期的重要過(guò)程。E蛋白是暴露于病毒體表面主要成份,因此,宿主針對(duì)DENV產(chǎn)生的中和抗體反應(yīng)也主要針對(duì)這一蛋白。該蛋白在空間上形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(envelope protein domain, ED),分別EDⅠ, EDⅡ和EDⅢ, EDⅠ位于中央,呈β環(huán)狀結(jié)構(gòu),通過(guò)構(gòu)象改變參與病毒進(jìn)入靶細(xì)胞和核衣殼的脫殼；ED Ⅱ位于側(cè)部,含有在黃病毒屬中高度保守的融合環(huán),參與細(xì)胞膜融合；EDⅢ呈免疫球蛋白樣折疊,被普遍認(rèn)為含有與靶細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)。三者均可在宿主體內(nèi)誘發(fā)抗體反應(yīng),但是研究表明,針對(duì)ED Ⅰ的抗體大多數(shù)是無(wú)中和活性的抗體；識(shí)別ED Ⅱ融合肽免疫顯性表位的抗體,在黃病毒屬成員間存在廣泛的交叉反應(yīng),但大多無(wú)相對(duì)應(yīng)的交叉中和活性；EDⅢ誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體中和活性最強(qiáng),并且絕大部分為登革病毒特異性抗體。 四型登革病毒之間E蛋白氨基酸序列同源性高達(dá)72%～80%,EDⅢ不僅存在血清型特異性中和表位,還存在登革病毒亞交叉或交叉反應(yīng)性中和表位,因此,以EDⅢ作為登革疫苗研制的靶標(biāo)可能產(chǎn)生同時(shí)針對(duì)四型登革病毒的中和抗體,具有廣譜抗病毒作用。由于目前尚無(wú)獲得批準(zhǔn)的登革疫苗或抗病毒藥物,對(duì)登革病毒和其他相關(guān)蟲(chóng)媒病毒的保護(hù)主要還是通過(guò)中和抗體介導(dǎo)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,EDⅢ中和抗體不管是被動(dòng)免疫或是治療性免疫均能獲得很好的保護(hù)效果。因此,若能獲得具有強(qiáng)中和活性的EDⅢ抗體,在病毒感染早期有效中和體內(nèi)登革病毒,對(duì)控制疾病加重具有重大意義。由此可見(jiàn),不管是登革病毒EDⅢ蛋白還是EDⅢ中和抗體在抗病毒研究中具有重要地位,它們是E蛋白廣譜交叉抗原表位分析、新型登革疫苗和抗病毒藥物研究的重要工具。 明確中和抗體與病毒的相互作用對(duì)登革病毒致病和免疫機(jī)制的闡明至關(guān)重要。目前所獲得的中和抗體的抗病毒特征絕大部分都來(lái)源于鼠源性單抗,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)表明中和活性最強(qiáng)的抗體主要針對(duì)EDⅢ抗原表位,對(duì)其表位特征亦已清晰闡明,識(shí)別位點(diǎn)主要位于EDⅢ的側(cè)脊和A鏈區(qū)。盡管有研究發(fā)現(xiàn)登革熱患者血清EDⅢ抗體與中和活性存在關(guān)聯(lián)性,但近年來(lái)一些研究也發(fā)現(xiàn)EDⅢ抗體僅占抗病毒免疫血清中很小一部分,絕大部分為交叉反應(yīng)性抗體,去除血清中EDⅢ抗體成份并未對(duì)血清的中和活性產(chǎn)生影響,推斷中和抗體識(shí)別表位可能位于EDⅢ以外部分。因此,EDⅢ抗體在天然抗病毒免疫中作用存在爭(zhēng)議,明確登革病毒患者血清中和抗體反應(yīng)的特點(diǎn)以及EDⅢ抗體對(duì)中和活性的作用,對(duì)于抗病毒的研究意義重大,也需要更多的臨床數(shù)據(jù)支撐。 本研究分為以下兩個(gè)部分內(nèi)容： 第一部分：登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)單抗的體內(nèi)外中和作用及其作用機(jī)制的初步研究 登革病毒包膜E蛋白是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白,該蛋白在空間上形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(EDⅠ, EDⅡ和EDⅢ)。研究認(rèn)為EDⅢ是參與病毒與宿主細(xì)胞吸附的區(qū)域,同時(shí)EDⅢ誘發(fā)的特異抗體的體內(nèi)外中和活性最強(qiáng)。因此,EDⅢ在登革病毒致病機(jī)制和抗病毒研究方面意義重大,已成為登革DNA或蛋白疫苗研制的重要靶標(biāo)。本研究中,我們?cè)O(shè)想構(gòu)建對(duì)四型登革病毒具有廣譜中和活性的EDⅢ反應(yīng)單抗。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中,以重組DENV1～4EDⅢ單獨(dú)或混合免疫小鼠制備了一批EDⅢ反應(yīng)性單抗,通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸咐實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)(Immuno-fluorescence assay, IFA)測(cè)定它們對(duì)四型登革病毒的反應(yīng)特性,發(fā)現(xiàn)一株單抗能同時(shí)與四型病毒相結(jié)合,表明它是一株登革病毒群叉反應(yīng)性單抗,命名為2D73。為了觀察單抗2D73對(duì)四型病毒是否也具有交叉中和活性,我們采用本實(shí)驗(yàn)室建立的基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的微中和實(shí)驗(yàn)方法(Enzyme-linked immunospot-based micro-neutralization test, ELISPOT-MNT),測(cè)定單抗對(duì)四型登革病毒的體外中和活性,結(jié)果顯示單抗2D73對(duì)四型病毒均具有較強(qiáng)的中和活性,其50%抑制濃度(50%inhibited concentration, IC50)分別為0.28、0.16、0.18和18.82μg/ml。以用1日齡昆明乳鼠作為登革病毒感染模型進(jìn)行抗體體內(nèi)保護(hù)性效果評(píng)價(jià),隨著抗體濃度的增加,乳鼠發(fā)病時(shí)間延遲、存活率顯著提高,呈明顯的濃度依賴關(guān)系,對(duì)四型登革病毒表現(xiàn)出與體外中和活性相平行的體內(nèi)保護(hù)作用。由于目前普遍認(rèn)為病毒與靶細(xì)胞結(jié)合的位點(diǎn)位于EDⅢ,因此EDⅢ抗體可能在抑制病毒與細(xì)胞吸咐方面具有重要作用。為進(jìn)一步揭示2D73中和作用的機(jī)制,我們采用前后吸咐試驗(yàn)檢測(cè)抗體在阻斷病毒與細(xì)胞吸咐的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體在前吸咐實(shí)驗(yàn)?zāi)苡行б种撇《靖腥炯?xì)胞,而在后吸咐試驗(yàn)中抗體抑制感染效果明顯降低,表明其中和作用主要通過(guò)抑制病毒與細(xì)胞表面受體的吸咐而有效阻斷了病毒進(jìn)入細(xì)胞。對(duì)重組EDⅢ蛋白與2D73抗體Fab段的晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),單抗2D73所識(shí)別表位在四型登革病毒中高度保守(見(jiàn)另一博士論文)。上述結(jié)果提示我們,包括2D73在內(nèi)的對(duì)DENV1～4中和活性強(qiáng)的抗體,它們所識(shí)別的高度保守性抗原表位有可能成為今后疫苗研制的重要靶標(biāo)。 第二部分：Ⅰ型登革病毒初次感染患者恢復(fù)期血清中和抗體效價(jià)與EDⅢ抗體滴度相關(guān)性分析 明確登革病毒感染患者中和抗體的反應(yīng)特點(diǎn),對(duì)于登革疫苗有效性評(píng)估、登革熱流行病學(xué)調(diào)查和感染診斷具有重要作用。目前對(duì)登革病毒中和抗體的研究大部分都基于鼠源性抗體,為了揭示天然免疫狀況下登革病毒感染者的中和抗體反應(yīng)特異性,以及明確抗體中和活性與EDⅢ抗體水平的關(guān)系,在本研究中,我們收集了30例明確診斷為Ⅰ型登革病毒初次感染的患者恢復(fù)期血清,利用ELISPOT-MNT測(cè)定每例血清對(duì)四型登革病毒的中和抗體效價(jià)。并建立一種特異、可靠的雙抗原夾心ELISA法用于檢測(cè)血清中EDⅢ特異性抗體的效價(jià),該方法以酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組EDⅢ蛋白作為抗原,捕獲血清中的特異性EDⅢ抗體,分析血清對(duì)DENV-1的中和效價(jià)與同型特異性EDⅢ抗體效價(jià)的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示,這些患者的恢復(fù)期血清對(duì)DENV-1中和活性最強(qiáng),而對(duì)其他三型病毒的中和活性遠(yuǎn)不如前者。這一結(jié)果提示,與登革病毒感染初期體內(nèi)的抗體反應(yīng)不同,隨時(shí)間推移,體內(nèi)針對(duì)其他血型的中和抗體中和活性下降,而同型特異性中和抗體的中和活性上升,成為最具優(yōu)勢(shì)的中和抗體。30例血清的EDⅢ抗體效價(jià)高低差異大,高者達(dá)到1：80,低者可低于臨界值,對(duì)DENV-1的中和效價(jià)與血清型特異EDⅢ抗體效價(jià)的相關(guān)性進(jìn)分析,發(fā)現(xiàn)兩者不存在相關(guān)性(R=0.194,P=0.305),這一發(fā)現(xiàn)與目前認(rèn)為的型特異性EDⅢ抗體并非介導(dǎo)同型登革病毒中和的主要抗體的理論相一致。 小結(jié) 綜上所述,本研究取得以下成果： 一、獲得了一株對(duì)四型登革病毒交叉反應(yīng)的EDⅢ鼠源性單抗,該抗體對(duì)四型登革病毒均有較強(qiáng)的體外中和活性,并具有與體外中和活性相平行的體內(nèi)保護(hù)作用。它通過(guò)阻斷病毒與細(xì)胞表面受體的吸咐而發(fā)揮中和作用。這一抗體可以進(jìn)一步用于E蛋白廣譜交叉抗原表位分析和抗登革病毒的治療。并為新型登革疫苗的研制提供新的思路。 二、建立了一種用于檢測(cè)登革病毒感染患者體內(nèi)EDⅢ抗體雙抗原夾心ELISA法,由于該方法采用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EDⅢ重組蛋白,蛋白具有更好折疊性,更接近于天然構(gòu)象。因此,以DENV-1EDⅢ重組蛋白作為包被抗原,以標(biāo)記了HRP的DENV-1EDⅢ重組蛋白作為檢測(cè)抗原,測(cè)定患者血清中的特異性EDⅢ抗體,具有更高的特異性、更好的可靠性。 三、用快速高通量的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微中和實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定30例Ⅰ型登革病毒初次感染患者三年后恢復(fù)期血清對(duì)四型登革病毒的中和效價(jià),統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)血清對(duì)同型病毒的中和效價(jià)最高,遠(yuǎn)高于對(duì)異型病毒的中和效價(jià),證實(shí)了登革病毒初次感染可產(chǎn)生終生有效的同型中和抗體。但血清的對(duì)Ⅰ型登革病毒的強(qiáng)中和活性與血清型特異性EDⅢ抗體水平的高低無(wú)關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 包膜蛋白Ⅲ區(qū) 中和抗體 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法 微中和實(shí)驗(yàn) 雙抗原夾心ELISA
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.33;R392
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-24
• 參考文獻(xiàn)21-24
• 第一章 登革病毒EDⅢ特異性單抗的中和作用與機(jī)制分析24-52
• 引言24-25
• 1 材料與方法25-39
• 2 結(jié)果39-45
• 3 討論45-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 第二章 Ⅰ型登革病毒感染患者恢復(fù)期血清中和抗體反應(yīng)分析52-68
• 引言52-53
• 1 材料與方法53-58
• 2 結(jié)果58-63
• 3 討論63-65
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 全文小結(jié)68-69
• 綜述69-81
• 參考文獻(xiàn)76-81
• 縮寫(xiě)詞簡(jiǎn)表81-82
• 致謝82-83
• 碩士研究生期間發(fā)表論文83-84

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10 楊杰;登革病毒EDⅢ蛋白的表達(dá)、純化及其與ECV304細(xì)胞相互作用蛋白的篩選與鑒定研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 黃艷芬;登革病毒包膜蛋白Ⅲ區(qū)單抗中和作用與作用機(jī)制研究以及登革病毒初次感染患者血清中和抗體反應(yīng)分析[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

2 付宇姣;登革Ⅱ型病毒E蛋白第一、二結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、鑒定及蚊蟲(chóng)組織中登革病毒受體分子的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

3 潘京;蚊蟲(chóng)細(xì)胞與蚊蟲(chóng)組織中登革病毒受體分子篩選與鑒定[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

4 朱小娟;登革病毒在宿主選擇壓力下基因組核苷酸變異與毒力的相關(guān)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

5 鄒林;登革病毒NS1抗原檢測(cè)技術(shù)的初步研究[D];暨南大學(xué);2010年

6 溫筱蕓;細(xì)胞因子在登革病毒感染人皮膚成纖維細(xì)胞中的作用[D];暨南大學(xué);2004年

7 張俊磊;登革病毒廣州2002年流行株的分離鑒定及登革病毒感染ECV304細(xì)胞分子機(jī)制的初探[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 馬秀芝;云南西南部地區(qū)健康人群登革病毒血清抗體調(diào)查及白紋伊蚊rDNA-ITS2序列初步分析[D];大理學(xué)院;2012年

9 王嘉麗;微絲骨架在登革病毒感染ECV304細(xì)胞中作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

10 段鴻元;登革3型病毒prME和NS1多基因重組質(zhì)粒DNA免疫原性增強(qiáng)效果觀察[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

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本文編號(hào)：972059