本文關(guān)鍵詞：b型流感嗜血桿菌多糖制備工藝及其D蛋白原核可溶性表達(dá)研究

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【摘要】：流感嗜血桿菌可引起人類多種傳染性疾病,最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的是腦膜炎,其次是肺炎。根據(jù)主要的毒力因子一莢膜的有無(wú),可將其分為兩大類有莢膜型和無(wú)莢膜型。前者有a、b、c、d、e、f六個(gè)莢膜型別,其中b型最為流行,主要感染對(duì)象為兒童,幾乎所有由hi(Haemophilus influenzae Hi)引起的腦膜炎病例和大多數(shù)其它菌血性病例均是感染b型菌所致。Hib是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題,其發(fā)病率高、死亡率高的特點(diǎn),促使科學(xué)工作者不斷研究如何用疫苗來(lái)預(yù)防Hib感染。自上世紀(jì)80年代Hib疫苗問(wèn)世以來(lái),目前全球已有九十多個(gè)國(guó)家使用這一疫苗。在兒童免疫規(guī)劃中常規(guī)接種疫苗的國(guó)家和地區(qū),Hib疾病發(fā)病率迅速下降甚至消失。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)Hib對(duì)氨芐青霉素和其它一些抗生素的耐藥率增高,通過(guò)疫苗預(yù)防Hib疾病變得比以往更要。 第一部分是b型流感嗜血桿菌多糖制備工藝的研究。 首先制備了b型流感嗜血桿菌CMCC58534株的種子批,并進(jìn)行了檢定,然后對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)與發(fā)酵,之后通過(guò)甲醛殺菌、沉淀復(fù)合糖、去除核酸、沉淀粗糖、苯酚抽提去除蛋白、超濾去除苯酚、沉淀精糖等步驟對(duì)其莢膜多糖進(jìn)行純化。通過(guò)幾批發(fā)酵培養(yǎng)與純化,對(duì)其生產(chǎn)工藝進(jìn)行了探討與優(yōu)化,最后確定發(fā)酵、純化條件,在此條件下進(jìn)行了連續(xù)三批100L發(fā)酵中試,得到的精糖產(chǎn)量均高于80mmg/L,且精糖鑒別試驗(yàn)、化學(xué)檢定、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均合格,核磁共振檢測(cè)證明其結(jié)構(gòu)正常。說(shuō)明生產(chǎn)工藝穩(wěn)定,能夠得到合格的Hib多糖。 第二部分是流感嗜血桿菌D蛋白基因工程可溶性表達(dá)。 流感嗜血桿菌蛋白D (Protein D, PD)是高度保守的表面脂蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量約42000,存在于所有可分型Hi和不可分型Hi(NTHi),是一種具有甘油磷酸二酯酶活性的細(xì)菌毒力因子,能導(dǎo)致宿主上皮細(xì)胞釋放磷酸膽堿,在Hi引起呼吸道感染過(guò)程中起重要作用。流感嗜血桿菌D蛋白作為疫苗載體已應(yīng)用于十價(jià)的肺炎結(jié)合苗中,在國(guó)外上市,安全性和免疫性均較好。本研究將Hib基因組DNA中去除信號(hào)肽的hpd基因片段插入pET43.1a表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3), IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白,經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀和DEAE sepharose Fast Flow陰離子交換層析純化后,通過(guò)Western blot的方法證明得到了具有良好免疫反應(yīng)原性的D蛋白。表達(dá)的蛋白以可溶性蛋白形式表達(dá),表達(dá)量約占菌株總蛋白的44%。
【關(guān)鍵詞】：b型流感嗜血桿菌 多糖 D蛋白 可溶性表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.41;Q78
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 前言8-11
• 1. Hib概況8-9
• 1.1 Hib病原學(xué)及流行病學(xué)8
• 1.2 Hib多糖免疫機(jī)理8-9
• 2. Hib結(jié)合疫苗9-11
• 2.1 結(jié)合方法9
• 2.2 結(jié)合用載體蛋白9-10
• 2.3 中國(guó)Hib疫苗應(yīng)用現(xiàn)狀10-11
• 3 本實(shí)驗(yàn)的目的及意義11
• 第一部分 b型流感嗜血桿菌的多糖的制備11-33
• 1. 材料11-13
• 1.1 菌株來(lái)源11
• 1.2 主要試劑11-12
• 1.3 主要儀器設(shè)備12-13
• 1.4 主要試劑配方13
• 2. 方法13-23
• 2.1 種子批制備及檢定13-15
• 2.2 Hib菌種的發(fā)酵培養(yǎng)15
• 2.3 多糖制備工藝15-17
• 2.4 連續(xù)三批100L發(fā)酵中試生產(chǎn)多糖的質(zhì)量鑒定17-23
• 3. 結(jié)果23-32
• 3.1 種子批檢定結(jié)果23-24
• 3.2 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中各項(xiàng)鑒定24-26
• 3.3 多糖制備工藝的優(yōu)化26-28
• 3.4 連續(xù)三批100L發(fā)酵中試生產(chǎn)多糖的質(zhì)量鑒定28-32
• 4. 討論32
• 5. 小結(jié)32-33
• 第二部分 b型流感嗜血桿菌D蛋白原核可溶性表達(dá)33-48
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料33
• 1.1 菌株及質(zhì)粒33
• 1.2 試劑33
• 1.3 主要器材與儀器33
• 1.4 主要試劑配方33
• 2. 方法33-40
• 2.1 HibCMCC58534株基因組的制備33-34
• 2.2 b型流感嗜血桿菌D蛋白(hpd)基因的擴(kuò)增34-35
• 2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及克隆35-38
• 2.4 D蛋白的原核表達(dá)38-39
• 2.5 重組D蛋白的純化39
• 2.6 重組D蛋白Western blot分析39-40
• 3. 結(jié)果40-45
• 3.1 b型流感嗜血桿菌D蛋白(hpd)基因的擴(kuò)增40
• 3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定40-43
• 3.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析43-44
• 3.4 D蛋白純化過(guò)程中SDS-PAGE分析44-45
• 3.5 重組D蛋白的Western blot分析45
• 4. 討論45-47
• 4.1 目的蛋白的分析與表達(dá)45
• 4.2 表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)載體的選擇45-46
• 4.3 重組D蛋白的表達(dá)46
• 4.4 重組D蛋白的純化46
• 4.5 本研究的意義46-47
• 5. 小結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 附錄1 縮略語(yǔ)52-53
• 附錄2 溶液配制53-60
• 致謝60-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷61-62

【參考文獻(xiàn)】

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