本文關(guān)鍵詞：牛布魯氏菌和牛分枝桿菌抗原的基因克隆、表達(dá)和抗原性鑒定

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【摘要】：快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)是防控和凈化牛布病和結(jié)核�。ㄒ韵路Q“牛兩病”）的前提，為了減少以撲殺的方式來(lái)消除牛兩病的流行，加強(qiáng)牛兩病疫情監(jiān)測(cè)及防治工作，通過(guò)市場(chǎng)提供安全、廉價(jià)、敏感、特異的多種牛布魯氏菌和牛分枝桿菌重組抗原，本研究擬克隆牛布魯氏菌和牛分枝桿菌抗原基因，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，并建行了重組抗原鑒定，，為牛血清中布魯氏菌抗體和結(jié)核桿菌抗體的檢測(cè)提供有價(jià)值的抗原，為我國(guó)牛兩病的診斷試劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。主要完成以下三個(gè)方面的研究工作： 1、利用PCR技術(shù)和基因工程技術(shù)，成功克隆了牛布魯氏菌BCSP31、BP26、Cu-Zn SOD、DnaK、L7/L12、OMP17.3、P39和牛分枝桿菌Ag85B、CFP10、ESAT-6、HBHA、MPB63、MPB70、MPB83共14個(gè)抗原基因，并成功構(gòu)建了這14個(gè)抗原基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，克隆的這14個(gè)抗原基因與預(yù)期克隆的目的基因在核苷酸序列及氨基酸序列上都具有高度的同源性，達(dá)99.3%以上。 2、將14個(gè)抗原基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌進(jìn)行原核表達(dá)，然后利用Ni柱親和層析法、電洗脫法等對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。結(jié)果得到大部分純度90%以上、濃度在1.0~2.0mg/mL的重組抗原。 3、通過(guò)建立的用于鑒定重組抗原抗原性的間接ELISA法，證明了本研究純化的牛布魯氏菌rBP26、rDnaK、rOMP17.3和牛分枝桿菌rAg85B、rCFP10、rESAT-6、rHBHA、rMPB70、rMPB83具有良好的抗原性，適于作為候選的診斷抗原，為牛血清中布魯氏菌抗體和結(jié)核桿菌抗體的檢測(cè)提供有價(jià)值的抗原。
【關(guān)鍵詞】：牛布魯氏菌 牛分枝桿菌 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.911;R378.5;Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 緒論7-16
• 1 布病與結(jié)核病的概述7-8
• 1.1 布病病原7
• 1.2 結(jié)核病病原7-8
• 1.3 流行特點(diǎn)8
• 2 布病與結(jié)核病的疫情8-10
• 2.1 布病疫情9
• 2.2 結(jié)核病疫情9-10
• 3 布病與結(jié)核病的診斷方法10-14
• 3.1 細(xì)菌學(xué)檢查10-11
• 3.2 免疫學(xué)檢驗(yàn)11-13
• 3.3 分子生物學(xué)檢測(cè)13-14
• 4 本論文的目的意義14-16
• 第二章 牛布魯氏菌和牛分枝桿菌幾種特異性診斷抗原基因的克隆16-39
• 1 材料17-19
• 1.1 菌種、基因組 DNA 與質(zhì)粒17
• 1.2 試劑17-18
• 1.3 主要儀器設(shè)備18-19
• 2 方法19-26
• 2.1 引物設(shè)計(jì)與合成19-20
• 2.2 目的基因的 PCR 擴(kuò)增20-21
• 2.3 PCR 產(chǎn)物的鑒定及純化21
• 2.4 牛布魯氏菌目的基因的 TA 克隆21-24
• 2.5 牛布魯氏菌和牛分枝桿菌重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建24-26
• 2.6 牛布魯氏菌和牛分枝桿菌重組原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定26
• 3 結(jié)果與分析26-34
• 3.1 目的基因的 PCR 擴(kuò)增26-27
• 3.2 牛布魯氏菌目的基因陽(yáng)性 TA 克隆的篩選與鑒定27-30
• 3.3 牛布魯氏菌和牛分枝桿菌重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建30-34
• 4 討論34-38
• 4.1 目的基因的選擇34-37
• 4.2 菌株模板 DNA 的選擇37
• 4.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建37-38
• 5 本章小結(jié)38-39
• 第三章 牛布魯氏菌和牛分枝桿菌重組抗原的表達(dá)、純化和抗原性鑒定39-69
• 1 材料39-41
• 1.1 菌種與質(zhì)粒39
• 1.2 血清39
• 1.3 試劑39-40
• 1.4 主要儀器設(shè)備40-41
• 2 方法41-49
• 2.1 重組原核表達(dá)菌的構(gòu)建41
• 2.2 小量誘導(dǎo)與優(yōu)勢(shì)表達(dá)菌種的篩選41-42
• 2.3 重組抗原的大量表達(dá)42-43
• 2.4 重組抗原的純化43-46
• 2.5 重組抗原的純度與濃度測(cè)定46-47
• 2.6 重組抗原的抗原性鑒定47-49
• 3 結(jié)果與分析49-65
• 3.1 小量誘導(dǎo)與優(yōu)勢(shì)表達(dá)菌種的篩選49-54
• 3.2 重組抗原的大量表達(dá)54-60
• 3.3 重組抗原的純度與濃度測(cè)定60
• 3.4 牛布魯氏菌重組抗原間接 ELISA 反應(yīng)條件的確定60-62
• 3.5 牛布魯氏菌重組抗原的抗原性鑒定62-64
• 3.6 牛分枝桿菌重組抗原的抗原性鑒定64-65
• 4 討論65-67
• 4.1 關(guān)于原核表達(dá)載體的選擇65-66
• 4.2 關(guān)于重組抗原的表達(dá)66
• 4.3 關(guān)于重組抗原的純化66
• 4.4 關(guān)于重組抗原的抗原性鑒定66-67
• 5 本章小結(jié)67-69
• 第四章 全文結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-76
• 附錄76-94
• 一、本論文中的部分英文縮略詞76-78
• 二、載體質(zhì)粒的圖譜信息78-80
• 三、部分實(shí)驗(yàn)試劑的配制80-84
• 四、基因測(cè)序序列84-94
• 在校期間發(fā)表論文清單94-95
• 致謝95

【參考文獻(xiàn)】

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