本文關(guān)鍵詞：人DSPP啟動子的分析及細(xì)胞牙向分化報告體系的建立

  更多相關(guān)文章： DSPP 啟動子 人牙胚間充質(zhì)細(xì)胞 地塞米松 雙熒光素酶 LacZ

【摘要】：牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)的表達是細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志。傳統(tǒng)檢測DSPP表達的方法有RT-PCR、免疫組化、Westem-Blot等,這些方法操作耗時費力,且大多不能進行定位分析。小鼠中已有基于Dspp啟動子構(gòu)建的重組報告基因檢測Dspp表達的系統(tǒng),人類DSPP啟動子的研究還未見相關(guān)報道,因此,本研究試圖分析人DSPP啟動子的結(jié)構(gòu)以及基于啟動子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上構(gòu)建hDSPP promoter-LacZ報告體系,從而快速定位檢測細(xì)胞是否向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。 DSPP基因表達屬于誘導(dǎo)表達,因此,本研究首先建立細(xì)胞表達DSPP的體系,主要是通過使用含地塞米松(Dexamethasone)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液來誘導(dǎo)人牙間充質(zhì)細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化；通過Real time.PCR分析,人牙間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)后,其DSPP的表達量明顯上升,說明使用地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液能夠在體外誘導(dǎo)牙源性干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。其次是人DSPP啟動子結(jié)構(gòu)的初步分析,主要是先通過在線軟件(TESS和Genomatix Software Suite)分析人DSPP啟動子擬區(qū)域序列-4000—+54的特征,包括啟動子的基本元件和順式作用元件的潛在分析；根據(jù)軟件分析結(jié)果設(shè)計引物克隆人DSPP啟動子擬區(qū)域的不同序列,分別是-4000—+54、-2500—+54、-1447—-+54、1027—+54,并將它們分別插入到熒光素酶報告載體pGL3-Basic上,構(gòu)建包含DSPP啟動子和熒光素酶報告基因的重組質(zhì)粒pGL3-LUC-hDSPP promoter,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pGL3-LUC-hDSPP promoter和內(nèi)參質(zhì)粒CMV-Renilla共轉(zhuǎn)染至人牙胚間充質(zhì)細(xì)胞中,地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)48-72h后,雙熒光素酶報告檢測DSPP啟動子的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的人DSPP啟動子擬序列中-2500—+54區(qū)域的活性最高,其次是-1447——+54。最后,根據(jù)啟動子活性測定結(jié)果,用-2500——+54區(qū)域的序列構(gòu)建phDSPP(-2500-+54)-LacZ漫病毒報告載體；用phDSPP (-2500-+54)-LacZ慢病毒感染人牙胚間充質(zhì)細(xì)胞,誘導(dǎo)培養(yǎng)后用X-Gal染色,結(jié)果與感染空載慢病毒的細(xì)胞相比,感染phDSPP(-2500-+54)-LacZ慢病毒的細(xì)胞部分區(qū)域呈藍色,說明phDSPP(-2500-+54)-LacZ報告系統(tǒng)可用于檢測體外細(xì)胞DSPP表達。 hDSPP啟動子的分析及其報告體系的建立有利于種子細(xì)胞牙向分化的快速檢測以及牙發(fā)育過程中生長因子和轉(zhuǎn)錄因子作用的研究。
【關(guān)鍵詞】：DSPP 啟動子 人牙胚間充質(zhì)細(xì)胞 地塞米松 雙熒光素酶 LacZ
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-7
• 目錄7-10
• 緒論10-20
• 一、哺乳動物牙齒發(fā)育10-11
• 二、干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的研究11-14
• (一) 干細(xì)胞與牙齒再生的研究進展11-13
• (二) 誘導(dǎo)牙源性干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的研究13-14
• 三、真核生物啟動子結(jié)構(gòu)14-15
• 四、外源基因?qū)爰?xì)胞常用的方法15-17
• 五、研究目的和意義17-20
• 第一章 材料與方法20-42
• 1.1 實驗材料20-24
• 1.1.1 實驗儀器與耗材20
• 1.1.2 菌株、載體與細(xì)胞20-21
• 1.1.3 實驗試劑21
• 1.1.4 實驗試劑配制21-24
• 1.1.5 引物24
• 1.2 實驗方法24-42
• 1.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備24-25
• 1.2.2 DNA提取25-26
• 1.2.3 PCR基因擴增26-29
• 1.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切29
• 1.2.5 電泳及割膠純化29-30
• 1.2.6 末端去磷酸化和連接反應(yīng)30-31
• 1.2.7 質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化31
• 1.2.8 轉(zhuǎn)化子的鑒定31-32
• 1.2.9 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、擴大培養(yǎng)及凍存32-33
• 1.2.10 誘導(dǎo)hEDMC/ihEDMC細(xì)胞表達DSPP33
• 1.2.11 細(xì)胞總RNA的提取33-34
• 1.2.12 Real-time PCR反應(yīng)34-35
• 1.2.13 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測啟動子活性35-36
• 1.2.14 磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,生產(chǎn)慢病毒36-38
• 1.2.15 慢病毒濃縮與滴度測定38-39
• 1.2.16 慢病毒感染hEDMC/ihEDMC4細(xì)胞(以6cm培養(yǎng)皿為例)39
• 1.2.17 細(xì)胞X-Gal染色39-42
• 第二章 結(jié)果42-66
• 2.1 細(xì)胞表達DSPP體系的建立42-43
• 2.2 DSPP啟動子有效序列位置的確定43-56
• 2.2.1 軟件分析DSPP啟動子擬序列的結(jié)構(gòu)特征43-44
• 2.2.2 pGL3-LUC-DSPP promoter載體的構(gòu)建44-53
• 2.2.3 hDSPP啟動子擬序列活性檢測(雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測法)53-56
• 2.3 人DSPP啟動子報告載體構(gòu)建及其用于牙向分化檢測的可行性分析56-66
• 2.3.1 phDSPP_((-2500-+54))-LacZ載體的構(gòu)建56-60
• 2.3.2 phDSPP_((-2500-+54))-LacZ慢病毒的生產(chǎn)及滴度測定60-62
• 2.3.3 phDSPP((-2500-+54))-LacZ報告載體用于牙向分化檢測的可行性分析62-66
• 第三章 分析與討論66-70
• 3.1 細(xì)胞表達DSPP體系的建立66-67
• 3.2 DSPP啟動子有效序列位置的確定67-69
• 3.2.1 pGL3-Basic-DSPP promoter載體的構(gòu)建67-68
• 3.2.2 啟動子活性檢測68-69
• 3.3 DSPP promoter報告體系的建立及可行性分析69-70
• 3.3.1 慢病毒包裝生產(chǎn)69
• 3.3.2 phDSPP_((-2500-+54))-LacZ用于細(xì)胞牙向分化檢測的可行性分析69-70
• 第四章 實驗結(jié)論70-72
• 參考文獻72-78
• 攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果78-80
• 致謝80-82
• 個人簡歷82-84

【共引文獻】

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3 逄鍵梁;人牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

4 汪銀雄;用牙髓干細(xì)胞構(gòu)建牙齒樣結(jié)構(gòu)的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

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本文編號：963499