本文關(guān)鍵詞：人細(xì)小病毒B19非結(jié)構(gòu)蛋白NS1核輸出機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 細(xì)小病毒B19 NS1 NES CRM1

【摘要】：人細(xì)小病毒B19(B19)在1974年首次被發(fā)現(xiàn),是細(xì)小病毒科(Parvoviridae)中已知的兩種感染人的病毒之一。B19病毒在人群中分布廣泛,感染后的臨床癥狀隨宿主的免疫系統(tǒng)和血液狀況的不同而不同,它主要引起兒童的傳染性紅斑和成年人的急性對(duì)稱關(guān)節(jié)炎,也能引發(fā)胎兒死亡、胎兒水腫、胎兒先天性貧血。目前主要的檢測(cè)手段是特異性抗體及病毒DNA檢測(cè),免疫球蛋白能有效緩解病情。 B19病毒是無(wú)囊膜的單鏈DNA病毒,基因組全長(zhǎng)5.4kb,兩端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的編碼序列全長(zhǎng)2013bp(nt435-2448),共編碼671個(gè)氨基酸,分子量為74kDa。研究報(bào)道,NS1能直接與病毒p6啟動(dòng)子結(jié)合并反式激活p6啟動(dòng)子調(diào)控病毒DNA的復(fù)制,NS1也能反式激活一些細(xì)胞啟動(dòng)子從而調(diào)控腫瘤壞死因子(TNF)-a和白介素(IL)-6的表達(dá)。與此同時(shí),NS1能引起細(xì)胞周期阻滯,讓細(xì)胞停留在G1期和S期,還能引起紅血細(xì)胞的凋亡。種種跡象均表明,NSl既能進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合并調(diào)控其啟動(dòng)子的活性,也能在細(xì)胞質(zhì)中與相關(guān)的蛋白結(jié)合從而調(diào)控細(xì)胞因子和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。前期有研究表明,NS1在敏感細(xì)胞系主要定位在細(xì)胞核,少量分布在細(xì)胞質(zhì)；另有研究稱,NS1在非敏感細(xì)胞系中全部定位在細(xì)胞質(zhì)；而相關(guān)文獻(xiàn)也證實(shí)NS1是一種核質(zhì)穿梭蛋白。但關(guān)于NS1的核質(zhì)穿梭機(jī)制研究甚少,因此本文將從以下幾個(gè)方面對(duì)NS1的這種核質(zhì)穿梭機(jī)制進(jìn)行初步研究： (1)確定NS1的核質(zhì)穿梭現(xiàn)象。用B19的感染性克隆pB19-4244轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,24小時(shí)后用LMB處理轉(zhuǎn)染后細(xì)胞,觀察NS1定位是否發(fā)生改變。隨后用NS1-pEFGP-N1的重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并進(jìn)行相似處理及結(jié)果分析。 (2)利用相關(guān)軟件對(duì)NS1蛋白序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)可能存在的核輸出信號(hào)(Nuclear Export Signal, NES)序列。根據(jù)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)系列截短方案,構(gòu)建野生型NS1及系列截短突變的NS1與pEGFP-N1的重組載體。將重組克隆轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分析數(shù)據(jù),初步確定NES在NS1上的分布情況。 (3)將初步確定的NES信號(hào)序列單獨(dú)與EGFP融合,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分析數(shù)據(jù),進(jìn)一步確定NES是否都有活性。對(duì)有活性的NES進(jìn)行關(guān)鍵位點(diǎn)的點(diǎn)突變,并同時(shí)在NS1全長(zhǎng)上將對(duì)應(yīng)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變,觀察突變是否改變蛋白定位。 (4)用LMB處理轉(zhuǎn)染后細(xì)胞,確定NES序列是CRM1依賴型還是CRM1非依賴型,然后用哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)NS1與CRM1的相互作用。 通過(guò)對(duì)pB19-4244轉(zhuǎn)染293T后的細(xì)胞進(jìn)行LMB處理,觀察到NS1從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核中,NS1-pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行相同處理得到類似結(jié)果,從而確定NS1是可以進(jìn)行核質(zhì)穿梭并且NS1的出核是依賴于CRM1的。其后,通過(guò)系列截短突變及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的點(diǎn)突變,確定兩個(gè)新的有生物活性的NES信號(hào),即NES1與NES2,并且LMB處理實(shí)驗(yàn)初步證明NES2為CRM1依賴型而NES1為CRM1非依賴型,同時(shí)NS1上還存在其他的NES信號(hào)序列。最后,通過(guò)哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng),我們檢測(cè)到NS1與CRM1的直接相互作用,進(jìn)一步說(shuō)明NS1的這種出核轉(zhuǎn)運(yùn)是依賴于CRM1的。本研究初步闡明了NS1的核質(zhì)穿梭機(jī)制,為NS1的功能研究提供一定的理論基礎(chǔ)及依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)小病毒B19 NS1 NES CRM1
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 前言12-26
• 1.1 人細(xì)小病毒B1912-16
• 1.1.1 人細(xì)小病毒B19的發(fā)現(xiàn)及歷史12
• 1.1.2 人細(xì)小病毒B19的分類學(xué)、形態(tài)學(xué)及基因組學(xué)研究12-14
• 1.1.3 人細(xì)小病毒B19的病原學(xué)及病理學(xué)研究14-15
• 1.1.4 人細(xì)小病毒B19的臨床表征15-16
• 1.1.5 人細(xì)小病毒B19的診斷及治療16
• 1.2 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的核質(zhì)穿梭機(jī)制研究16-20
• 1.2.1 蛋白質(zhì)的入核轉(zhuǎn)運(yùn)18-19
• 1.2.2 蛋白質(zhì)的出核轉(zhuǎn)運(yùn)19-20
• 1.3 人細(xì)小病毒B19非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的核質(zhì)穿梭機(jī)制研究20-22
• 1.3.1 人細(xì)小病毒B19非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的結(jié)構(gòu)及基本性質(zhì)20-21
• 1.3.2 細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核質(zhì)穿梭機(jī)制研究21
• 1.3.3 人細(xì)小病毒B19 NS1的核質(zhì)穿梭機(jī)制研究21-22
• 1.4 哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)22-24
• 1.4.1 哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介22-24
• 1.4.2 哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)在本實(shí)驗(yàn)中的具體應(yīng)用24
• 1.5 本研究目的和意義24-26
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料及方法26-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 2.1.1 菌株及其培養(yǎng)基26
• 2.1.2 質(zhì)粒及其提取試劑26-27
• 2.1.3 細(xì)胞系及其培養(yǎng)基27
• 2.1.4 其他27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-35
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)29-30
• 2.2.2 重組載體的構(gòu)建30-32
• 2.2.3 高純質(zhì)粒的提取32-33
• 2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染33
• 2.2.5 LMB處理33-34
• 2.2.6 制片及共聚焦顯微鏡觀察34
• 2.2.7 哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)的具體實(shí)驗(yàn)方案34-35
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析35-49
• 3.1 NS1的亞細(xì)胞定位35-37
• 3.1.1 免疫熒光檢測(cè)NS1的細(xì)胞內(nèi)定位35
• 3.1.2 NS1-EGFP融合蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位35-36
• 3.1.3 NS1與其他細(xì)胞器的共定位研究36-37
• 3.2 NS1的核輸出過(guò)程依賴于CRM137-39
• 3.2.1 免疫熒光檢測(cè)NS1的定位改變37-38
• 3.2.2 NS1-EGFP融合蛋白的定位改變38-39
• 3.3 NS1核輸出信號(hào)(NES)的初步確定39-43
• 3.3.1 不含NLS/NES的NS1截短突變蛋白的定位39-40
• 3.3.2 含三個(gè)NES的NS1截短突變蛋白的定位40
• 3.3.3 含兩個(gè)NES的NS1截短突變蛋白的定位40-41
• 3.3.4 含一個(gè)NES的NS1截短突變蛋白的定位41-42
• 3.3.5 NES介導(dǎo)EGFP的出核轉(zhuǎn)運(yùn)42-43
• 3.4 依賴于CRM1的核輸出信號(hào)(NES)的確定43-44
• 3.4.1 NS1截短突變蛋白的定位改變43-44
• 3.4.2 NS1-NES-EGFP融合蛋白的定位改變44
• 3.5 NES關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的確定44-47
• 3.5.1 NS1-NES關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的突變44-46
• 3.5.2 NS1全長(zhǎng)上NES關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的突變46-47
• 3.6 哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)NS1與CRM1的直接相互作用47-49
• 第四章 討論及展望49-52
• 4.1 討論49-50
• 4.2 展望50-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 附錄57-58
• 致謝58

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 Kwabena Obeng Duedu;Kwamena William Coleman Sagoe;Patrick Ferdinand Ayeh-Kumi;Raymond Bedu Affrim;Theophilus Adiku;;The effects of co-infection with human parvovirus B19 and Plasmodium falciparum on type and degree of anaemia in Ghanaian children[J];Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine;2013年02期

2 馬慶林;于淼;羅迪;談娟;喬文濤;;原型泡沫病毒Bel1蛋白核定位信號(hào)精細(xì)定位及相互作用核輸入蛋白初探[J];病毒學(xué)報(bào);2014年04期

3 張智勇;李國(guó)瑞;邱靜;羅蕊;李雪雁;任國(guó)雙;陳永勝;;基于細(xì)胞質(zhì)的葉綠體蛋白靶向機(jī)制[J];黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年01期

4 祁燃;許楠;張傳茂;;高等動(dòng)物細(xì)胞核膜和核纖層結(jié)構(gòu)、功能及動(dòng)態(tài)變化調(diào)控機(jī)制[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2013年10期

5 陳斯;王建;楊曉明;;蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控蛋白質(zhì)核轉(zhuǎn)運(yùn)及其功能[J];生命科學(xué);2008年05期

6 李竹石;許彩民;;通過(guò)核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2009年10期

7 阮崢;王文天;楊洋;段永娟;胡曉;;第三代慢病毒包裝系統(tǒng)優(yōu)化及Rev表達(dá)質(zhì)粒對(duì)慢病毒包裝效率作用初探[J];生物技術(shù)通訊;2014年06期

8 齊特;楊華乾;范雪新;趙天;郭運(yùn)波;丁衛(wèi);葉海虹;;用于細(xì)胞核鈣成像的新型鈣指示劑的構(gòu)建與鑒定（英文）[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2015年06期

9 王帥玉;盛清;呂正兵;陳健;聶作明;王丹;劉立麗;沈紅丹;舒建洪;陳劍清;吳祥甫;張耀洲;;家蠶Bm595的表達(dá)、組織分布及亞細(xì)胞定位[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年03期

10 李曼;陳晨;陶澤璋;陳始明;周俊旭;;蛋白質(zhì)的核質(zhì)轉(zhuǎn)位在細(xì)胞凋亡及癌變過(guò)程中的研究進(jìn)展[J];腫瘤防治研究;2012年10期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周芳;黃鱔AR基因的克隆、表達(dá)及其蛋白的核質(zhì)穿梭[D];武漢大學(xué);2010年

2 王立洪;腫瘤標(biāo)志物中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（NGAL）與鈣調(diào)磷酸酶B同源蛋白2（CHP2）的生物學(xué)功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

3 李竹石;亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡過(guò)程中MnSOD上調(diào)機(jī)制的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

4 錢冠華;NIRF蛋白對(duì)HBV核心蛋白的作用及其機(jī)制的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

5 趙慧;兒童腹瀉相關(guān)的人博卡病毒2型的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

6 牛少芳;煙草壞死病毒A外殼蛋白的核質(zhì)穿梭及其功能分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 蔡錦陽(yáng);鋅指蛋白KRAB結(jié)構(gòu)域入核及ZNF300在K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的功能探索[D];武漢大學(xué);2013年

8 周學(xué);文昌魚microRNA及其合成代謝相關(guān)蛋白的識(shí)別、鑒定及比較基因組分析[D];南京師范大學(xué);2014年

9 肖利民;miR-517c通過(guò)KPNA2干擾p53核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制GBM自噬及EMT樣表型的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

10 段志強(qiáng);新城疫病毒M蛋白功能結(jié)構(gòu)域突變以及M蛋白與細(xì)胞核磷蛋白B23互作影響病毒復(fù)制的分子機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陳春峰;水稻phyA基因轉(zhuǎn)化擬南芥的功能研究[D];華南理工大學(xué);2011年

2 陳斯;核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白質(zhì)KPNA2與轉(zhuǎn)錄因子c-Jun相互作用及其生物學(xué)意義初探[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

3 王健;Ndrg2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

4 李超;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的豌豆花瓣瞬間表達(dá)系統(tǒng)的建立及利用該系統(tǒng)對(duì)百脈根TCP基因亞細(xì)胞定位的研究[D];上海交通大學(xué);2009年

5 周陽(yáng);牦牛、犏牛睪丸組織DEAD-box家族基因表達(dá)、選擇性剪接與啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

6 楊廷;L-periaxin蛋白核輸出機(jī)制的初步分析[D];山西大學(xué);2013年

7 張曉瑜;利用VBIM系統(tǒng)篩選與EV71感染相關(guān)的宿主細(xì)胞因子[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

8 張?jiān)氯A;TLR7,9和人細(xì)小病毒B19在橋本甲狀腺炎病變甲狀腺組織中的相互關(guān)系[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

9 許愛(ài)霞;黃瓜花葉病毒2b蛋白與擬南芥核輸入蛋白alpha的互作研究[D];浙江理工大學(xué);2013年

10 司陽(yáng);多發(fā)性骨髓瘤糖皮質(zhì)激素受體亞型表達(dá)及調(diào)控在激素抵抗中的作用研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：961908