本文關鍵詞：宿主miRNA抑制A型流感病毒復制的作用研究

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【摘要】：A型流感病毒屬于正粘病毒科，單股負鏈的RNA病毒。由于其宿主廣泛、傳染性強、傳播速度快，短時間內可造成局部地區(qū)的爆發(fā)或全球范圍的流行。自19世紀以來，已爆發(fā)四次全球性的流感大流行，其中1918年爆發(fā)的“西班牙流感H1N1”大流行最為嚴重，造成全世界近5000萬人死亡，給人類健康和全球經(jīng)濟帶來了極大的危害。目前，針對A型流感病毒感染的預防和治療措施主要是采用離子通道阻斷劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑等抗病毒藥物，但是這些藥物對于人體神經(jīng)系統(tǒng)均有一定的副作用，而且由于A型流感病毒基因變異快，隨著藥物的大量使用，極易產(chǎn)生耐藥性毒株。因此，進行流感病毒治療藥物及抗病毒靶標研究迫在眉睫。 微小RNA（miRNA）是長度約22nt的非編碼單鏈小RNA分子，廣泛存在于真核生物基因組中，其基因位置及序列都十分保守。miRNA主要通過互補結合到靶標mRNA上而起到轉錄后基因表達調控的作用，參與許多細胞過程，包括細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤形成等。目前，已有研究表明宿主miRNA在乙肝病毒、丙肝病毒及人類免疫缺陷病毒等多種病毒感染中通過對宿主或病毒的基因表達進行調控，從而影響病毒復制、侵染及致病等過程。此外，由于miRNA的作用途徑專一且效果明顯，miRNA及其靶點已成為治療病毒性疾病特效基因藥物的研究熱點。 A型流感病毒基因組由8個節(jié)段組成，前三個節(jié)段編碼聚合酶蛋白PB2、PB1和PA，三者共同組成RNA依賴的RNA聚合酶蛋白復合體。第五個節(jié)段編碼核蛋白NP，包裹著病毒的核酸，起保護作用。在流感病毒復制過程中NP、病毒RNA及三個聚合酶蛋白共同組成核糖核蛋白復合體（RNPs），不僅參與病毒基因的轉錄與翻譯，還在病毒RNA及蛋白的入核、出核及胞質聚集過程中發(fā)揮著重要的功能。這四個基因節(jié)段不僅功能重要，而且存在很多保守位點，因此針對以上基因尋找新的藥物靶位，研制穩(wěn)定的抗流感病毒藥物具有舉足輕重的作用。本研究以流感病毒聚合酶蛋白基因和核蛋白基因為靶點，尋找廣譜調控A型流感病毒復制的宿主miRNA并確定miRNA的靶位點，為宿主抗病毒防御機制提供更深層次的理解，也為應用生物信息學方法來開發(fā)廣譜抗流感病毒的基因藥物及尋找新抗病毒靶點奠定基礎。 本研究首先利用生物信息學方法預測并篩選廣譜靶向A型流感病毒復制相關基因的宿主miRNA。我們以miRNA靶標預測軟件miRanda為主體，設計了廣譜靶向A型流感病毒基因的宿主miRNA的預測篩選流程。采用Perl語言編程從miRanda軟件輸出結果中提取有用信息，并通過設定嚴格的軟件參數(shù)，制定詳盡的篩選原則，使篩選出的miRNA兼具廣譜靶向率高與抑制病毒復制效果好等優(yōu)點。針對PB2基因，挑選了miR-188-3p和miR-345；針對PB1基因，挑選了miR-3183；針對PA基因，挑選了miR-15a*和miR-99b*；針對NP基因，挑選了miR-769-3p；篩選的6個miRNA對A型流感病毒的廣譜靶向率分別為81.3%，95%，78.7%，83.1%，64.4%和95.3%。 隨后從季節(jié)性流感病毒A/FM/1/47(H1N1)毒株中擴增PB1、PB2、PA及NP基因全長并構入T載體中，通過測序獲得了該毒株的基因序列，miRanda軟件預測結果顯示所篩選的6個miRNA在該毒株上均具有良好的靶向性，堿基對匹配結合模式具有代表性，可以利用該毒株進行miRNA的功能驗證。 采用一系列實驗方法逐步驗證miRNA抑制A型流感病毒復制的效果。 1.首先采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行初步篩選，根據(jù)miRNA的熒光抑制率判定miRNA與潛在靶標的結合能力。結果顯示生物信息學篩選出的6條miRNA與潛在靶標均有一定的結合能力，但是靶向于PA基因的miR-15a*和miR-99b*熒光抑制率較小，僅為28.82%和20.75%；其余4條miRNA與潛在靶標結合能力較強：miR-188-3p和miR-345可靶向結合PB2基因，miR-3183可靶向結合PB1基因，三者熒光抑制率均達到45%左右。miR-769-3p可靶向結合NP基因，熒光抑制率為36.5%。 2.進一步驗證miRNA對A型流感病毒蛋白表達的影響。首先構建了表達PB1、PB2、PA及NP蛋白基因的真核表達載體，并與人工合成的miRNA模擬物共轉染HEK293T細胞。Western印跡結果顯示4條miRNA均可顯著抑制相應病毒蛋白的表達。其中miR-769-3p對NP蛋白表達的抑制效果最為顯著。miR-188-3p和miR-345對PB2蛋白表達的抑制效果、miR-3183對PB1蛋白表達的抑制效果與陽性對照miRNA（miR-491）對靶標蛋白PB1蛋白表達的抑制效果基本一致。 3.最后，，觀察miRNA對A型流感病毒復制的抑制效果。首先驗證了季節(jié)性流感病毒A/FM/1/47(H1N1)毒株在MDCK細胞系及A549細胞系上的復制動力學特性，繪制了一步生長曲線，確定了病毒最佳接毒劑量，隨后利用最佳病毒感染劑量進行了miRNA抑制流感病毒復制實驗。實驗結果表明miR-188-3p可顯著抑制A型流感病毒在A549細胞上的復制，與對照組相比，病毒感染后48h病毒滴度降低0.8個TCID50。miR-345效果其次，可使病毒感染后48h病毒滴度降低0.51個TCID50。二者均優(yōu)于陽性對照miR-491，其僅使病毒感染后48h病毒滴度降低0.43個TCID_(50)。 基于以上研究，我們通過生物信息學預測及一系列實驗驗證最終篩選到一個miRNA，即miR-188-3p，可廣譜靶向結合A型流感病毒PB2基因，抑制PB2蛋白表達，顯著抑制A型流感病毒的復制。不僅如此，我們通過生物信息學方法分析發(fā)現(xiàn)miR-188-3p對近期爆發(fā)的人感染H7N9禽流感病毒PB2基因也具有很好的靶向性，而且其靶向效果優(yōu)于A/FM/1/47(H1N1)毒株。本研究的成果為宿主抗流感病毒防御機制提供了更深層次的理解，同時提出了一種廣譜靶向抑制流感病毒的miRNA篩選方法，為應用生物信息學方法來挖掘抗A型流感病毒的miRNA基因藥物的研究奠定了理論基礎。
【關鍵詞】：A型流感病毒 聚合酶蛋白 核蛋白 微小RNA 靶向
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373.13
【目錄】：

• 縮略詞5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-23
• 1 A 型流感病毒概況13-15
• 1.1 A 型流感病毒治療藥物研究概況14-15
• 2 miRNA 簡介15-17
• 2.1 miRNA 基因15
• 2.2 miRNA 的合成過程15-17
• 2.3 miRNA 的作用機制17
• 3 miRNA 與病毒17-21
• 3.1 病毒編碼的 miRNA 調節(jié)病毒和宿主基因表達18-19
• 3.2 宿主 miRNA 在病毒感染過程中的調節(jié)作用19-20
• 3.3 miRNA 作為抗病毒靶基因藥物前景20-21
• 3.4 miRNA 靶標預測軟件21
• 4 本論文的目的意義與研究思路21-23
• 第一章 生物信息學篩選廣譜靶向 A 型流感病毒復制相關基因的宿主 miRNA23-32
• 1 實驗數(shù)據(jù)及方法23-27
• 1.1 硬件設備23
• 1.2 miRanda 軟件安裝與參數(shù)設置23-24
• 1.3 人成熟 miRNA 的序列24-25
• 1.4 人感染 A 型流感病毒的序列25-27
• 2 實驗結果27-30
• 2.1 數(shù)據(jù)采集及 miRNA 靶標預測27-28
• 2.2 miRNA 靶標預測結果的定性分析28-29
• 2.3 廣譜靶標 A 型流感病毒復制相關基因的 miRNA 篩選29-30
• 3 小結與討論30-32
• 第二章 宿主 miRNA 抑制 A 型流感病毒復制的功能驗證32-61
• 1 實驗材料及儀器32-37
• 1.1 載體、菌株、細胞及毒株來源32
• 1.2 主要試劑32-34
• 1.3 主要試劑的配制34-36
• 1.4 主要儀器36-37
• 2 實驗方法37-46
• 3 實驗結果46-58
• 3.1 A 型流感病毒 PB1、PB2、PA 及 NP 基因的擴增及分析46-48
• 3.2 預測的 miRNA 在 A 型流感病毒上與靶基因的結合能力分析48-50
• 3.3 預測的 miRNA 對 A 型流感病毒蛋白表達的抑制作用50-54
• 3.4 預測的 miRNA 對 A 型流感病毒復制的抑制作用54-58
• 4 小結與討論58-61
• 結論61-62
• 參考文獻62-67
• 文獻綜述67-77
• 參考文獻74-77
• 研究論文77-88
• 個人簡歷88-89
• 致謝89-90

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本文編號：941919