本文關(guān)鍵詞：小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶4、6的原核表達(dá)和多克隆抗體制備

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【摘要】：在肥胖、糖尿病、粥樣動脈硬化和腹主動脈瘤等代謝疾病發(fā)病機(jī)制中，肥大細(xì)胞起著重要的作用。小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶4、6（mMCP4、mMCP6）是小鼠肥大細(xì)胞特異蛋白酶，在肥大細(xì)胞相關(guān)疾病生物學(xué)中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。但是，，市場上并沒有較好的商品化抗體，在一定程度上限制了這些肥大細(xì)胞蛋白酶細(xì)節(jié)作用機(jī)制的研究。因此，原核表達(dá)并制備這些蛋白酶的抗體，將有利于深入探討肥大細(xì)胞的相關(guān)作用機(jī)制。 本研究，構(gòu)建了小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶4(mMCP4)和6(mMCP6)的原核表達(dá)體系，誘導(dǎo)表達(dá)并純化了包涵體蛋白，并通過多次皮下注射制備了兔抗mMCP4和兔抗mMCP6多克隆抗體。 其具體方法包括：(1)提取小鼠脾細(xì)胞總RNA，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)獲得目的基因mMCP4、 mMCP6；(2)構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET28a-mMCP4、pET28a-mMCP6，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，以異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；(3)利用Ni親和層析柱純化mMCP4、mMCP6融合蛋白；(4)純化后重組蛋白作為抗原免疫兔子獲得mMCP4多克隆抗體、mMCP6多克隆抗體；(5)采用ELISA法測抗體效價，western blot測抗體特異性。 其具體結(jié)果表明：(1)經(jīng)測序驗(yàn)證，所擴(kuò)增目的基因mMCP4、mMCP6序列準(zhǔn)確，所構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mMCP4、 pET28a-mMCP6成功；(2)經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，所誘導(dǎo)并純化的mMCP4、mMCP6融合包涵體蛋白分子量符合預(yù)期，條帶單一；(3)經(jīng)ELISA測定，所得兔抗mMCP4血清和兔抗mMCP6血清效價分別達(dá)到1:128000和1:32000；(4)經(jīng)western blot和免疫組化分析，表明mMCP4、mMCP6多克隆抗體具有較好的特異性。 總之，通過克隆、原核表達(dá)和多次免疫，我們成功地獲得兩種具有良好的效價和特異性的抗體，可用于免疫學(xué)檢測法，能滿足利用之進(jìn)一步研究肥大細(xì)胞的生物學(xué)功能的要求。
【關(guān)鍵詞】：小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶4(mMCP4) 小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶6(mMCP6) 原核表達(dá) 抗體制備
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-8
• 致謝8-14
• 第一章 緒論14-25
• 1.1 肥大細(xì)胞相關(guān)代謝疾病的研究背景14-16
• 1.1.1 肥胖相關(guān)代謝疾病15
• 1.1.2 肥大細(xì)胞與肥胖15-16
• 1.1.3 相關(guān)功能食品對肥胖的作用16
• 1.2 類糜蛋白酶和類胰蛋白酶簡介16-18
• 1.2.1 類糜蛋白酶簡介16
• 1.2.2 類胰蛋白酶簡介16-17
• 1.2.3 類胰蛋白酶的生物學(xué)效應(yīng)17-18
• 1.3 類糜蛋白酶和類胰蛋白酶相關(guān)疾病18-23
• 1.3.1 類胰蛋白酶的研究進(jìn)展19-20
• 1.3.2 類糜蛋白酶和類胰蛋白酶在哮喘中的作用20-21
• 1.3.3 類糜蛋白酶與組織纖維化21
• 1.3.4 類糜蛋白酶和類胰蛋白酶在心血管疾病中的作用21-22
• 1.3.5 類糜蛋白酶和類胰蛋白酶與腫瘤的關(guān)系22
• 1.3.6 類胰蛋白酶與皮膚炎癥22
• 1.3.7 類胰蛋白酶與關(guān)節(jié)炎癥22-23
• 1.3.8 類胰蛋白酶與其他疾病23
• 1.4 小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶研究背景23-25
• 1.4.1 mMCP4 的研究背景23-24
• 1.4.2 mMCP6 的研究背景24-25
• 第二章 小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶 4 的原核表達(dá)25-36
• 2.1 材料與方法25-32
• 2.1.1 主要試劑25
• 2.1.2 主要儀器25-26
• 2.1.3 菌株和載體26
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)動物26
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)方法26-32
• 2.2 結(jié)果與分析32-35
• 2.2.1 RT-PCR 擴(kuò)增 mMCP432-33
• 2.2.2 重組原核表達(dá)載體 pET28a-mMCP4 的構(gòu)建33
• 2.2.3 SDS-PAGE 檢測重組蛋白 mMCP4 在大腸桿菌 BL21 中的表達(dá)33-34
• 2.2.4 融合蛋白 mMCP4 的純化34-35
• 2.3 討論35-36
• 第三章 兔抗 mMCP4 多克隆抗體的制備36-43
• 3.1 材料與方法36-40
• 3.1.1 主要試劑36
• 3.1.2 主要儀器36-37
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)動物37
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)方法37-40
• 3.2 結(jié)果與分析40-41
• 3.2.1 ELISA 法檢測抗血清效價40
• 3.2.2 western blot 檢測40-41
• 3.2.3 免疫組化41
• 3.3 討論41-43
• 第四章 小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶 6 的原核表達(dá)43-49
• 4.1 材料與方法43-46
• 4.1.1 主要試劑43
• 4.1.2 主要儀器43
• 4.1.3 菌株和載體43
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)動物43
• 4.1.5 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 4.2 結(jié)果與分析46-48
• 4.2.1 RT-PCR 擴(kuò)增目的基因46
• 4.2.2 pET28a-mMCP6 表達(dá)載體的構(gòu)建46-47
• 4.2.3 SDS-PAGE 檢測重組蛋白 mMCP6 在大腸桿菌 BL21 中的表達(dá)47
• 4.2.4 融合蛋白 mMCP6 的純化47-48
• 4.3 討論48-49
• 第五章 兔抗 mMCP6 多克隆抗體的制備49-52
• 5.1 材料與方法49
• 5.1.1 主要試劑49
• 5.1.2 主要儀器49
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)動物49
• 5.1.4 實(shí)驗(yàn)方法49
• 5.2 結(jié)果與分析49-51
• 5.2.1 ELISA 法檢測抗血清效價49-50
• 5.2.2 western blot 檢測50
• 5.2.3 免疫組化50-51
• 5.3 討論51-52
• 第六章 展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 碩士期間發(fā)表的論文60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 衛(wèi)志燕;高彩榮;;類糜蛋白酶與疾病的關(guān)系研究[J];山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年02期

2 李軍;王曉敏;竇忠英;李勇;;Nanog基因的原核表達(dá)及抗體制備[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2012年07期

本文編號：933356