本文關(guān)鍵詞：HRSP12慢病毒載體的構(gòu)建、功能研究及RYBP核定位信號(hào)的鑒定

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【摘要】：熱反應(yīng)蛋白12(Heat-responsive protein12, HRSP12)于1995年從溶于5%高氯酸的大鼠肝臟組織中首先被發(fā)現(xiàn)。鑒定發(fā)現(xiàn)其屬于YER057c/YIL051c/YjgF家族成員,主要在肝臟和腎臟組織中有較高表達(dá),具核糖核酸酶活性,通過(guò)降解mRNA抑制蛋白質(zhì)合成,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。研究表明,HRSP12與腫瘤的發(fā)生有關(guān),能夠抑制DMBA誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。近期的研究還發(fā)現(xiàn),HRSP12的mRNA和蛋白質(zhì)水平在人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁的正常組織。因此,我們希望通過(guò)對(duì)HRSP12的研究,了解HRSP12在腫瘤發(fā)生發(fā)展及凋亡誘導(dǎo)中的作用機(jī)理。 RYBP是多梳蛋白家族成員,參與多梳蛋白抑制復(fù)合物1(Polycomb repressive complex1, PRC1)的組成,抑制Hox基因和分化相關(guān)基因等的表達(dá),在個(gè)體發(fā)育、干細(xì)胞分化、X染色體失活和腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。RYBP還可與多個(gè)凋亡調(diào)節(jié)蛋白相互作用,比如與細(xì)胞質(zhì)中的FADD、Pro-Caspase8/10、Hippi和Apoptin,以及細(xì)胞核中的DEDD等相互作用,在胞質(zhì)和胞核中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。RYBP還可以通過(guò)與MDM2相互作用,抑制MDM2對(duì)p53蛋白的泛素化降解,穩(wěn)定和激活p53的活性,引發(fā)腫瘤細(xì)胞周期阻滯,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RYBP蛋白主要定位在細(xì)胞核內(nèi),并在細(xì)胞質(zhì)中少量分布。盡管RYBP蛋白可以定位于細(xì)胞核,但是該蛋白核定位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知之甚少。 本論文的第一部分是構(gòu)建HRSP12的慢病毒表達(dá)載體,感染宮頸癌HeLa細(xì)胞,并用Western blot檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)Flag-HRSP12融合蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)的HRSP12能夠促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞中Caspase-3的剪切,并抑制細(xì)胞增殖,表明HRSP12在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)還可能與誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡有關(guān)。 本論文的第二部分是利用生物信息學(xué)分析結(jié)合DNA重組技術(shù),構(gòu)建了一系列RYBP基因截短體或突變體與GFP綠色熒光蛋白基因融合的重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染三株腫瘤細(xì)胞,在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP-RYBP截短體／突變體融合蛋白在不同細(xì)胞內(nèi)的定位。結(jié)果顯示,RYBP蛋白中的3段序列--6KKSPTRPKR14、47RKGTSTRKPR56及74PPPKKEKKEKVEKQDK89具有核定位功能,3段序列單獨(dú)與GFP融合后主要定位于細(xì)胞核內(nèi),第3段序列可以引導(dǎo)只在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)定位的PKLR(丙酮酸激酶)進(jìn)入細(xì)胞核,基本確定了這3段序列為RYBP的核定位信號(hào)。進(jìn)一步將這3段序列中的4個(gè)堿性氨基酸突變?yōu)楸彼?構(gòu)建了RYBP全長(zhǎng)的胞質(zhì)定位的突變體RYBPmut,用Western blot檢測(cè)RYBPmut在HEK293T細(xì)胞中對(duì)p53蛋白的作用,結(jié)果顯示,與野生型RYBP蛋白相比,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)定位的RYBPmut蛋白更能夠增加細(xì)胞內(nèi)p53的蛋白水平,其具體的作用機(jī)制還需要深入研究。 綜上所述,本論文利用HRSP12慢病毒表達(dá)載體證實(shí),HRSP12蛋白可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡并抑制其增殖,為HRSP12的深入研究提供了線索。首次鑒定了RYBP蛋白中的核定位序列,構(gòu)建了胞質(zhì)定位的突變體RYBPmut,發(fā)現(xiàn)其能夠增加細(xì)胞內(nèi)p53的蛋白水平,初步揭示了RYBP蛋白中核定位的氨基酸順序,為深入研究RYBP這一新的腫瘤抑制因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了新的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：HRSP12 慢病毒載體 RYBP 核定位信號(hào)
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞8-10
• 前言10-17
• 1. HRSP12蛋白10-13
• 2. RYBP蛋白13-17
• 實(shí)驗(yàn)材料17-31
• 1. 菌株17
• 2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞株17
• 3. 引物17-23
• 4. 載體23-26
• 5. 儀器設(shè)備26-27
• 6. 試劑27-28
• 7. 試劑配制28-31
• 第一部分 HRSP12慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響31-47
• 1. 實(shí)驗(yàn)方法31-41
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 3. 討論45-47
• 第二部分 RYBP蛋白質(zhì)核定位信號(hào)的鑒定、胞質(zhì)定位全長(zhǎng)突變體的構(gòu)建及功能研究47-77
• 1. 實(shí)驗(yàn)方法47-49
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-73
• 3. 討論73-77
• 總結(jié)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-81
• 致謝81-83
• 個(gè)人簡(jiǎn)介83-84

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 馬雯;陳虹;黃秉仁;陳等;;RYBP慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2013年09期

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本文編號(hào)：928273