本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌CFP10基因密碼子優(yōu)化DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效應(yīng)的評價

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【摘要】：目的：（1）構(gòu)建包含密碼子優(yōu)化CFP10基因的結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o。 （2）初步評價該疫苗免疫小鼠所誘導的免疫效應(yīng)。 方法：（1）根據(jù)小鼠和人的密碼子使用偏好，使用Gene Optimizer軟件對結(jié)核分枝桿菌CFP10蛋白的編碼基因進行優(yōu)化，但不改變其氨基酸的序列。優(yōu)化后的CFP10基因序列由南京金斯瑞公司進行全基因合成并插入真核表達載體pVAX1，構(gòu)建包含密碼子優(yōu)化CFP10基因的真核表達質(zhì)粒pVAX1/CFP10-o。同時，從結(jié)核分枝桿菌H37Ra株基因組中，PCR擴增天然密碼子CFP10基因，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，純化后的酶切產(chǎn)物CFP10基因與經(jīng)同樣酶切處理的真核表達載體pVAX1連接，構(gòu)建包含天然密碼子CFP10基因的重組質(zhì)粒pVAX1/CFP10，，用酶切及測序的方法鑒定pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。（2）以EcoRⅠ和HindⅢ將質(zhì)粒pVAX1/CFP10進行雙酶切獲得CFP10基因，亞克隆至原核表達載體pET42a(+)中，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET42a/CFP10，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導下表達重組蛋白CFP10，獲得的蛋白經(jīng)His親和層析柱純化，并采用SDS-PAGE電泳和western blot對表達產(chǎn)物進行分析和鑒定。純化后的蛋白再通過去細菌去內(nèi)毒素試劑盒進一步純化去除內(nèi)毒素，并以鱟試驗檢測內(nèi)毒素去除效果。（3）大量提取經(jīng)鑒定正確的包含密碼子優(yōu)化CFP10基因的真核表達質(zhì)粒pVAX1/CFP10-o及包含天然密碼子CFP10基因的pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒，經(jīng)梭華-SofastTM介導體外轉(zhuǎn)染Hela細胞，并通過RT-PCR、間接免疫熒光法檢測重組質(zhì)粒是否能在真核細胞內(nèi)表達；將pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒以肌肉注射輔以體內(nèi)電穿孔的方式體內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌，免疫組織化學法檢測其在骨骼肌細胞內(nèi)的表達情況。（4）將28只SPF級BALB/c小鼠分為4組，即pVAX1/CFP10-o組，pVAX1/CFP10組，pVAX1空質(zhì)粒組，NS（生理鹽水）組，分別以pVAX1/CFP10-o、pVAX1/CFP10、pVAX1質(zhì)粒和NS經(jīng)肌肉注射輔以體內(nèi)電穿孔途徑進行免疫，每2w加強免疫一次，共免疫3次。間接ELISA法檢測初次免疫后0、2、4、6w小鼠血清中CFP10特異性抗體IgG的水平；ELISA法檢測末次免疫后2w（第6w）小鼠血清中IFN-γ的濃度；ELISPOT法檢測末次免疫后2w（第6w）小鼠脾淋巴細胞和重組蛋白CFP10共培養(yǎng)后產(chǎn)生IFN-γ的T淋巴細胞數(shù)量；流式細胞儀檢測CFSE標記的末次免疫后2w（第6w）小鼠T淋巴細胞經(jīng)重組蛋白CFP10刺激后的增殖動力學變化，用flowjo軟件分析其增殖指數(shù)。 結(jié)果：（1）構(gòu)建的pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切電泳鑒定均分別于約3000bp和300bp處各見1條帶；測序結(jié)果顯示插入基因序列均分別與設(shè)計的CFP10優(yōu)化基因和結(jié)核分枝桿菌H37Rv株CFP10編碼基因序列一致。（2）成功構(gòu)建pET42a/CFP10質(zhì)粒,經(jīng)酶切電泳鑒定分別于約5900bp和300bp處各見1條帶；測序結(jié)果顯示插入基因序列與結(jié)核桿菌H37Rv株CFP10編碼基因序列一致。轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的BL21（DE3）經(jīng)過0.1mmol/L IPTG、37℃誘導6h，高效表達了占菌體蛋白總量40%的可溶性融合蛋白，經(jīng)His親和層析柱純化后的相對分子量約為37KD的蛋白能與CFP10多克隆抗體發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)ToxinEraserT M去內(nèi)毒素試劑盒進行去除內(nèi)毒素處理后，鱟試劑檢測蛋白內(nèi)毒素為陰性。（3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核Hela細胞后經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果顯示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10質(zhì)粒組均得到預(yù)期的目的條帶；間接免疫熒光結(jié)果顯示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細胞均可見特異性綠色熒光，且pVAX1/CFP10-o組熒光強度高于pVAX1/CFP10組，空質(zhì)粒pVAX1組和NS組未見特異性綠色熒光；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌細胞后免疫組織化學結(jié)果顯示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10組小鼠肌肉組織內(nèi)均有棕黃色陽性顆粒，pVAX1/CFP10-o組多于pVAX1/CFP10組，pVAX1組和NS組未見明顯的棕黃色陽性顆粒。（4）pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10組小鼠血清CFP10特異性IgG抗體水平檢測顯示隨免疫次數(shù)的增多呈上升趨勢，在相同的免疫時間內(nèi)，pVAX1/CFP10-o組高于pVAX1/CFP10組。末次免疫后2w（第6w），兩組IgG抗體水平達到最高，且pVAX1/CFP10-o組小鼠血清CFP10特異性IgG抗體水平明顯高于pVAX1/CFP10組和pVAX1組及NS組（p㩳0.05），pVAX1/CFP10組高于pVAX1組及NS組（p㩳0.05），而pVAX1組和NS組小鼠血清CFP10特異性IgG抗體水平差異無統(tǒng)計學意義（p㧐0.05）；pVAX1/CFP10-o組小鼠血清IFN-γ濃度明顯高于pVAX1/CFP10組和pVAX1組及NS組（p㩳0.01），pVAX1/CFP10組小鼠血清IFN-γ濃度高于pVAX1組及NS組（p㩳0.01），而pVAX1組和NS組小鼠血清IFN-γ濃度差異無統(tǒng)計學意義（p㧐0.05）；ELISPOT結(jié)果顯示pVAX1/CFP10-o組斑點數(shù)明顯多于pVAX1/CFP10組和pVAX1組及NS組（p㩳0.01），pVAX1/CFP10組斑點數(shù)多于pVAX1組及NS組（p㩳0.01），而pVAX1組及NS組斑點數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（p㧐0.05）；各組T細胞的增殖指數(shù)檢測顯示pVAX1/CFP10-o組（2.89±0.39%）明顯高于pVAX1/CFP10組（2.06±0.16%）（p㩳0.05），pVAX1/CFP10組明顯高于pVAX1組和NS組（p㩳0.05），而pVAX1組和NS組之間差異無統(tǒng)計學意義（p㧐0.05）。 結(jié)論： （1）成功構(gòu)建了包含CFP10基因密碼子優(yōu)化結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和包含CFP10基因天然密碼子的結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10。 （2）成功高效原核表達了可溶性CFP10重組蛋白并獲得了無內(nèi)毒素的純化蛋白。 （3）轉(zhuǎn)染pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10質(zhì)粒的Hela細胞和小鼠骨骼肌均可有效表達CFP10蛋白，且轉(zhuǎn)染pVAX1/CFP10-o質(zhì)粒的Hela細胞和小鼠骨骼肌表達CFP10蛋白的效果更佳。 （4）結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10均可誘導BALB/c小鼠產(chǎn)生CFP10特異性的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，且pVAX1/CFP10-o DNA疫苗誘導產(chǎn)生的CFP10特異性的免疫應(yīng)答水平更高。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 CFP10基因 密碼子優(yōu)化 DNA疫苗 體液免疫應(yīng)答 細胞免疫應(yīng)答
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-38
• 1. 材料15-19
• 2. 方法19-38
• 結(jié)果38-54
• 討論54-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻61-67
• 致謝67-68
• 附錄 A 英中文術(shù)語與縮略詞對照表68-69
• 附錄 B 常用試劑配制69-72
• 附錄 C 個人簡歷和發(fā)表文章72-73
• 附錄 D 結(jié)核 DNA 疫苗綜述73-86
• 參考文獻81-86

【參考文獻】

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本文編號：925354