本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌CFP10基因密碼子優(yōu)化DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效應(yīng)的評價(jià)

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【摘要】：目的：（1）構(gòu)建包含密碼子優(yōu)化CFP10基因的結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o。 （2）初步評價(jià)該疫苗免疫小鼠所誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)。 方法：（1）根據(jù)小鼠和人的密碼子使用偏好，使用Gene Optimizer軟件對結(jié)核分枝桿菌CFP10蛋白的編碼基因進(jìn)行優(yōu)化，但不改變其氨基酸的序列。優(yōu)化后的CFP10基因序列由南京金斯瑞公司進(jìn)行全基因合成并插入真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建包含密碼子優(yōu)化CFP10基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1/CFP10-o。同時(shí)，從結(jié)核分枝桿菌H37Ra株基因組中，PCR擴(kuò)增天然密碼子CFP10基因，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，純化后的酶切產(chǎn)物CFP10基因與經(jīng)同樣酶切處理的真核表達(dá)載體pVAX1連接，構(gòu)建包含天然密碼子CFP10基因的重組質(zhì)粒pVAX1/CFP10，，用酶切及測序的方法鑒定pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。（2）以EcoRⅠ和HindⅢ將質(zhì)粒pVAX1/CFP10進(jìn)行雙酶切獲得CFP10基因，亞克隆至原核表達(dá)載體pET42a(+)中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET42a/CFP10，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組蛋白CFP10，獲得的蛋白經(jīng)His親和層析柱純化，并采用SDS-PAGE電泳和western blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定。純化后的蛋白再通過去細(xì)菌去內(nèi)毒素試劑盒進(jìn)一步純化去除內(nèi)毒素，并以鱟試驗(yàn)檢測內(nèi)毒素去除效果。（3）大量提取經(jīng)鑒定正確的包含密碼子優(yōu)化CFP10基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1/CFP10-o及包含天然密碼子CFP10基因的pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒，經(jīng)梭華-SofastTM介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，并通過RT-PCR、間接免疫熒光法檢測重組質(zhì)粒是否能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；將pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒以肌肉注射輔以體內(nèi)電穿孔的方式體內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌，免疫組織化學(xué)法檢測其在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。（4）將28只SPF級BALB/c小鼠分為4組，即pVAX1/CFP10-o組，pVAX1/CFP10組，pVAX1空質(zhì)粒組，NS（生理鹽水）組，分別以pVAX1/CFP10-o、pVAX1/CFP10、pVAX1質(zhì)粒和NS經(jīng)肌肉注射輔以體內(nèi)電穿孔途徑進(jìn)行免疫，每2w加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次。間接ELISA法檢測初次免疫后0、2、4、6w小鼠血清中CFP10特異性抗體IgG的水平；ELISA法檢測末次免疫后2w（第6w）小鼠血清中IFN-γ的濃度；ELISPOT法檢測末次免疫后2w（第6w）小鼠脾淋巴細(xì)胞和重組蛋白CFP10共培養(yǎng)后產(chǎn)生IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)量；流式細(xì)胞儀檢測CFSE標(biāo)記的末次免疫后2w（第6w）小鼠T淋巴細(xì)胞經(jīng)重組蛋白CFP10刺激后的增殖動(dòng)力學(xué)變化，用flowjo軟件分析其增殖指數(shù)。 結(jié)果：（1）構(gòu)建的pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切電泳鑒定均分別于約3000bp和300bp處各見1條帶；測序結(jié)果顯示插入基因序列均分別與設(shè)計(jì)的CFP10優(yōu)化基因和結(jié)核分枝桿菌H37Rv株CFP10編碼基因序列一致。（2）成功構(gòu)建pET42a/CFP10質(zhì)粒,經(jīng)酶切電泳鑒定分別于約5900bp和300bp處各見1條帶；測序結(jié)果顯示插入基因序列與結(jié)核桿菌H37Rv株CFP10編碼基因序列一致。轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的BL21（DE3）經(jīng)過0.1mmol/L IPTG、37℃誘導(dǎo)6h，高效表達(dá)了占菌體蛋白總量40%的可溶性融合蛋白，經(jīng)His親和層析柱純化后的相對分子量約為37KD的蛋白能與CFP10多克隆抗體發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)ToxinEraserT M去內(nèi)毒素試劑盒進(jìn)行去除內(nèi)毒素處理后，鱟試劑檢測蛋白內(nèi)毒素為陰性。（3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核Hela細(xì)胞后經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果顯示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10質(zhì)粒組均得到預(yù)期的目的條帶；間接免疫熒光結(jié)果顯示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞均可見特異性綠色熒光，且pVAX1/CFP10-o組熒光強(qiáng)度高于pVAX1/CFP10組，空質(zhì)粒pVAX1組和NS組未見特異性綠色熒光；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌細(xì)胞后免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10組小鼠肌肉組織內(nèi)均有棕黃色陽性顆粒，pVAX1/CFP10-o組多于pVAX1/CFP10組，pVAX1組和NS組未見明顯的棕黃色陽性顆粒。（4）pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10組小鼠血清CFP10特異性IgG抗體水平檢測顯示隨免疫次數(shù)的增多呈上升趨勢，在相同的免疫時(shí)間內(nèi)，pVAX1/CFP10-o組高于pVAX1/CFP10組。末次免疫后2w（第6w），兩組IgG抗體水平達(dá)到最高，且pVAX1/CFP10-o組小鼠血清CFP10特異性IgG抗體水平明顯高于pVAX1/CFP10組和pVAX1組及NS組（p㩳0.05），pVAX1/CFP10組高于pVAX1組及NS組（p㩳0.05），而pVAX1組和NS組小鼠血清CFP10特異性IgG抗體水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p㧐0.05）；pVAX1/CFP10-o組小鼠血清IFN-γ濃度明顯高于pVAX1/CFP10組和pVAX1組及NS組（p㩳0.01），pVAX1/CFP10組小鼠血清IFN-γ濃度高于pVAX1組及NS組（p㩳0.01），而pVAX1組和NS組小鼠血清IFN-γ濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p㧐0.05）；ELISPOT結(jié)果顯示pVAX1/CFP10-o組斑點(diǎn)數(shù)明顯多于pVAX1/CFP10組和pVAX1組及NS組（p㩳0.01），pVAX1/CFP10組斑點(diǎn)數(shù)多于pVAX1組及NS組（p㩳0.01），而pVAX1組及NS組斑點(diǎn)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p㧐0.05）；各組T細(xì)胞的增殖指數(shù)檢測顯示pVAX1/CFP10-o組（2.89±0.39%）明顯高于pVAX1/CFP10組（2.06±0.16%）（p㩳0.05），pVAX1/CFP10組明顯高于pVAX1組和NS組（p㩳0.05），而pVAX1組和NS組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p㧐0.05）。 結(jié)論： （1）成功構(gòu)建了包含CFP10基因密碼子優(yōu)化結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和包含CFP10基因天然密碼子的結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10。 （2）成功高效原核表達(dá)了可溶性CFP10重組蛋白并獲得了無內(nèi)毒素的純化蛋白。 （3）轉(zhuǎn)染pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10質(zhì)粒的Hela細(xì)胞和小鼠骨骼肌均可有效表達(dá)CFP10蛋白，且轉(zhuǎn)染pVAX1/CFP10-o質(zhì)粒的Hela細(xì)胞和小鼠骨骼肌表達(dá)CFP10蛋白的效果更佳。 （4）結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10均可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生CFP10特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且pVAX1/CFP10-o DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的CFP10特異性的免疫應(yīng)答水平更高。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 CFP10基因 密碼子優(yōu)化 DNA疫苗 體液免疫應(yīng)答 細(xì)胞免疫應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-38
• 1. 材料15-19
• 2. 方法19-38
• 結(jié)果38-54
• 討論54-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 致謝67-68
• 附錄 A 英中文術(shù)語與縮略詞對照表68-69
• 附錄 B 常用試劑配制69-72
• 附錄 C 個(gè)人簡歷和發(fā)表文章72-73
• 附錄 D 結(jié)核 DNA 疫苗綜述73-86
• 參考文獻(xiàn)81-86

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王慶敏;殷明;章建程;胡家慶;何穎;孫樹漢;;泛素-結(jié)核抗原融合基因DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年03期

2 張海;師長宏;王麗梅;薛瑩;柏銀蘭;徐志凱;;表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫原性[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年06期

3 李暉;李榕;鐘森;李強(qiáng);任紅;黃永茂;陳宣世;龍漢安;;結(jié)核病Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗免疫保護(hù)效果研究[J];免疫學(xué)雜志;2007年02期

4 胡方靖;武軍駐;;pIHsp65GM的構(gòu)建及其對結(jié)核桿菌感染小鼠的保護(hù)[J];免疫學(xué)雜志;2011年08期

5 蔣青桃;馮旰珠;夏梅;陳霞;邱文;趙聃;王迎偉;;結(jié)核桿菌ESAT-6抗原Th1優(yōu)勢表位與FL重組納米疫苗的制備及其特性研究[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年05期

6 張海;師長宏;薛瑩;柏銀蘭;王麗梅;徐志凱;;結(jié)核分枝桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白誘導(dǎo)的小鼠免疫應(yīng)答及其保護(hù)力[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年04期

7 吳碧蓮;陳少強(qiáng);賈小力;;梭華-Sofast介導(dǎo)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年16期

8 張華耀;木薩;徐金芳;阿斯曼;;接種卡介苗激發(fā)肺結(jié)核7例分析報(bào)告[J];西藏醫(yī)藥雜志;1995年S1期

9 梁艷;吳雪瓊;張俊仙;陽幼榮;王蘭;李洪敏;李忠明;史迎昌;;結(jié)核分枝桿菌Ag85A/ESAT-6嵌合型質(zhì)粒DNA疫苗和抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療小鼠耐藥結(jié)核病的效果研究[J];中國防癆雜志;2007年05期

10 都偉欣;董娜;陳保文;徐苗;楊蕾;盧錦標(biāo);沈小兵;王國治;;結(jié)核病新疫苗的免疫毒理學(xué)評價(jià)方法研究[J];中國防癆雜志;2012年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 由慶睿;Ag85B-ESAT6重組結(jié)核疫苗研究[D];吉林大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 杜合娟;密碼子優(yōu)化對乙肝病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫原性的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

2 魯飛;密碼子優(yōu)化聯(lián)合體內(nèi)電穿孔增強(qiáng)日本血吸蟲TPI DNA疫苗免疫保護(hù)作用的研究[D];江蘇省血吸蟲病防治研究所;2009年

本文編號：925354