本文關(guān)鍵詞：Tat-TSP2HD融合蛋白的免疫學(xué)特性及其對(duì)日本血吸蟲感染保護(hù)的研究

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【摘要】：血吸蟲病作為嚴(yán)重危害人類健康、影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展最重要的寄生蟲病之一，一直受到高度關(guān)注。血吸蟲病廣泛流行于亞洲、南美洲、非洲等76個(gè)發(fā)展中國(guó)家，目前全球受威脅人口達(dá)7.79億人，患病人數(shù)達(dá)2.07億人。在我國(guó)流行的日本血吸蟲病迄今仍然是我國(guó)重大公共衛(wèi)生問題之一。目前，我國(guó)血吸蟲病的防治手段是“以切斷蟲卵污染環(huán)境為關(guān)鍵措施，控制傳染源為主的血吸蟲病綜合防治新策略”。這一綜合防治措施取得了較好的防控效果，但是影響血吸蟲病傳播與流行的因素仍然存在。因此，研制安全有效的疫苗，獲得化療“短效”作用與疫苗接種誘導(dǎo)較“長(zhǎng)效”的免疫預(yù)防作用相結(jié)合的雙重效應(yīng)是綜合防治日本血吸蟲病的重要目標(biāo)之一。 血吸蟲感染早期即可激活宿主的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生針對(duì)血吸蟲童蟲、成蟲和蟲卵抗原的獲得性免疫應(yīng)答。其中分泌IFN-γ的CD4~+T細(xì)胞在抗血吸蟲保護(hù)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。在輻射致弱尾蚴感染小鼠獲得高保護(hù)力的研究中發(fā)現(xiàn)，CD4~+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、IFN-γ依賴的免疫效應(yīng)機(jī)制是其獲得高保護(hù)力的重要原因。IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，可能是清除肺期童蟲的重要效應(yīng)因子。另一方面，研究亦認(rèn)為血吸蟲感染小鼠體內(nèi)的CD8~+T細(xì)胞在血吸蟲產(chǎn)卵前和產(chǎn)卵后以及血吸蟲病的慢性期均能夠被活化，通過分泌IFN-γ發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性效應(yīng)中，亦有研究提示CD8~+T細(xì)胞亦能夠發(fā)揮一定的抗感染作用。 抗原提呈細(xì)胞（APC）特別是樹突狀細(xì)胞（DC）對(duì)血吸蟲抗原的處理和遞呈是宿主在感染血吸蟲后產(chǎn)生獲得性免疫的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。DC將血吸蟲抗原攝取、加工處理后，通過主要組織相容性復(fù)合物（MHC）分子Ⅰ類和Ⅱ類途徑可誘導(dǎo)CD4~+T和CD8~+T依賴的保護(hù)性免疫應(yīng)答。 將重組表達(dá)的血吸蟲抗原轉(zhuǎn)入到DC中，則能夠直接地觀察血吸蟲抗原被DC加工處理后對(duì)T細(xì)胞的作用。Tat-PTD能夠不依賴內(nèi)吞作用而將蛋白等轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞和組織內(nèi)。本研究擬采用原核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建TSP2HD[日本血吸蟲四跨膜蛋白2（Schistosoma japonicum Tetraspanin-2）第二親水基團(tuán)]和Tat-PTD的融合蛋白，以Western blot分析融合蛋白Tat-TSP2HD的血吸蟲抗原特性；以細(xì)胞免疫熒光分析融合蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能；以流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法分析融合蛋白對(duì)骨髓來源樹突狀細(xì)胞（Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC）表面標(biāo)志的表達(dá)和分泌細(xì)胞因子的作用；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）檢測(cè)負(fù)載融合蛋白后的DC對(duì)同種異體CD4~+和CD8~+T細(xì)胞的刺激效應(yīng)；以Tat-TSP2HD負(fù)載的BMDC、TSP2HD負(fù)載的BMDC和BMDC分別經(jīng)足墊免疫C57BL/6J小鼠，1周后用尾蚴進(jìn)行攻擊感染，感染6周后剖殺，計(jì)數(shù)成蟲數(shù)和蟲卵數(shù)，HE染色觀察肝臟病理變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟免疫細(xì)胞分型。 本研究獲得如下主要結(jié)果： 1．構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白Tat-TSP2HD和TSP2HD。 根據(jù)Tat-PTD和日本血吸蟲四跨膜蛋白基因第二親水基團(tuán)（TSP2HD）的核酸序列設(shè)計(jì)引物，PCR合成目的片段Tat-TSP2HD和TSP2HD。將目的片段定向克隆到表達(dá)載體pET-32a（+）的His標(biāo)簽蛋白下游，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-Tat-TSP2HD和pET-32a（+）-TSP2HD。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BMRosetta（DE3）中獲得含此重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白Tat-TSP2HD和TSP2HD。用Ni Sephrose6Fast Flow柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，獲得純化的融合蛋白，并用Endotoxin Removing Gel去除內(nèi)毒素。 2．融合蛋白Tat-TSP2HD作為抗原可被日本血吸蟲感染的小鼠血清所識(shí)別，具有特異性。 以日本血吸蟲感染小鼠血清和正常小鼠血清作為一抗，進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果顯示，Tat-TSP2HD和TSP2HD蛋白均能夠與日本血吸蟲感染的小鼠血清發(fā)生反應(yīng)，可見一條明顯的特異性反應(yīng)條帶，而與正常小鼠血清作用則無特異性條帶出現(xiàn)。 3．融合蛋白Tat-TSP2HD能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)，具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。 將蛋白Tat-TSP2HD加入到293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，，熒光顯微鏡觀察蛋白進(jìn)入細(xì)胞的情況。結(jié)果顯示，與蛋白Tat-TSP2HD共培養(yǎng)的293T細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)較多的紅色熒光，證明Tat-PTD能夠介導(dǎo)融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)中，發(fā)揮蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。 4．融合蛋白Tat-TSP2HD能夠誘導(dǎo)BMDCs的活化和成熟。 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志結(jié)果顯示，Tat-TSP2HD蛋白作用后能夠顯著刺激BMDCs各種表面標(biāo)志的表達(dá)，且MHCⅠ、CD40、CD86的表達(dá)水平高于TSP2HD蛋白作用后；ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果顯示，Tat-TSP2HD蛋白能夠刺激BMDCs分泌較多的細(xì)胞因子IL-12p70和IL-10，且與TSP2HD蛋白相比，Tat-TSP2HD蛋白能夠使BMDCs分泌更高水平的IL-10。 5．融合蛋白Tat-TSP2HD負(fù)載BMDCs能夠顯著刺激T細(xì)胞的增殖，且CD8~+T細(xì)胞的增殖水平顯著高于TSP2HD蛋白負(fù)載BMDC組。 將融合蛋白Tat-TSP2HD負(fù)載的BMDCs與同種異體CD4~+和CD8~+T細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR），3H-TdR摻入法檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示蛋白Tat-TSP2HD負(fù)載DC能夠有效刺激CD4~+和CD8~+T細(xì)胞的增殖，且CD8~+T細(xì)胞的增殖水平顯著高于蛋白TSP2HD負(fù)載BMDCs組。 6．融合蛋白Tat-TSP2HD負(fù)載BMDCs免疫小鼠，攻擊感染后，能夠獲得一定的保護(hù)力。 以Tat-TSP2HD負(fù)載的BMDCs、TSP2HD負(fù)載的BMDCs、PBS處理的BMDCs分別免疫小鼠，1周后用40±2條尾蚴進(jìn)行攻擊感染，6周后剖殺。結(jié)果顯示，與PBS-DC對(duì)照組相比，Tat-TSP2HD-DC組獲得36.56%（P0.05）的減蟲率和23.58%的減卵率。肝臟病理顯示，Tat-TSP2HD-DCs組的平均單個(gè)蟲卵肉芽腫面積小于TSP2HD-DCs和PBS-DCs對(duì)照組。流式檢測(cè)脾細(xì)胞免疫細(xì)胞分型結(jié)果顯示，Tat-TSP2HD-DCs組小鼠中脾單個(gè)核細(xì)胞中Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、CD8~+T細(xì)胞、Tc1細(xì)胞、Tc2細(xì)胞的比例均略高于TSP2HD-DCs和PBS-DCs對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 綜上，本研究構(gòu)建表達(dá)的融合蛋白Tat-TSP2HD具有血吸蟲抗原的特異性和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，能夠有效地誘導(dǎo)未成熟DC向成熟DC的轉(zhuǎn)化，蛋白負(fù)載DC在體內(nèi)外均能活化CD4~+和CD8~+T細(xì)胞，發(fā)揮部分抗血吸蟲感染的作用。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 樹突狀細(xì)胞 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 四跨膜蛋白 2（TSP2）
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R383.24
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 pET32a（+）-Tat-TSP2HD 載體構(gòu)建與蛋白表達(dá)16-40
• 一、實(shí)驗(yàn)材料16-21
• 二．實(shí)驗(yàn)方法21-35
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-40
• 第二部分 Tat-TSP2HD 融合蛋白免疫學(xué)特性的研究40-55
• 一、實(shí)驗(yàn)材料40-43
• 二、實(shí)驗(yàn)方法43-49
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-55
• 第三部分 Tat-TSP2HD 融合蛋白對(duì)日本血吸蟲感染保護(hù)的研究55-68
• 一、實(shí)驗(yàn)材料55-57
• 二、實(shí)驗(yàn)方法57-62
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-68
• 討論68-72
• 小結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 綜述80-89
• 參考文獻(xiàn)86-89
• 附錄89-90
• 致謝90-91

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王憲鋒,劉忠湘,李淑梅,繆軍,李s

本文編號(hào)：923272