本文關(guān)鍵詞：自噬通路在泛素連接酶Hrd1介導(dǎo)的α1-抗胰蛋白酶Z突變體降解中的作用

  更多相關(guān)文章： α1抗胰蛋白酶 Z型突變體 自噬 Hrd1 p62 LC3

【摘要】：α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin, AAT）屬于絲氨酸蛋白酶超家族成員，由肝細(xì)胞合成和分泌，可以抑制包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶等多種蛋白酶活性，但其主要作用是通過血液循環(huán)到達(dá)肺部，保護(hù)肺組織彈力纖維免受中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的水解和破壞。AAT缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳病，由于編碼AAT蛋白的基因突變而引起AAT分泌障礙所致，其中最常見的突變?yōu)閆型突變，占臨床病例的95%以上，該突變編碼的蛋白為AAT Z突變體(α1-antitrypsin Z variant,ATZ)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶Hrd1可促進(jìn)泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ATZ降解，且Hrd1顯著降低SDS不溶性和多聚體ATZ的水平。 目的： 觀察Hrd1是否可以通過自噬通路介導(dǎo)ATZ降解，同時探究其相關(guān)作用機(jī)制。 方法： 1.利用免疫熒光雙標(biāo)觀察細(xì)胞形態(tài)和蛋白定位情況； 2.分別加入放線菌酮(cycloheximide, CHX)抑制蛋白質(zhì)的合成，MG132抑制蛋白酶體活性，HBSS培養(yǎng)液誘導(dǎo)自噬，BFA1和氯化銨抑制自噬； 3.利用siRNA技術(shù)，合成Hrd1-siRNA抑制內(nèi)源性Hrd1表達(dá)，觀察ATZ降解的情況； 4. real-time PCR技術(shù)檢測共表達(dá)Hrd1和ATZ后對自噬相關(guān)基因Atg5，Atg12和Beclin-1的影響； 5.免疫共沉淀方法(Co-immunoprecipitation, Co-IP)檢測ATZ與K48位泛素、p62之間的相互作用。 結(jié)果： 1.自噬參與Hrd1介導(dǎo)的ATZ降解 1.1Hrd1促進(jìn)ATZ與自噬體膜蛋白LC3共定位 哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3，即18kDa的LC3-I和16kDa的LC3-II。LC3-I廣泛分布于胞漿中，當(dāng)自噬發(fā)生時，Atg7活化LC3并促使LC3與Atg3結(jié)合，LC3-I與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）結(jié)合稱為LC3-II，LC3-II定位于自噬體膜的兩側(cè)。LC3-II的含量或LC3-II/LC3-I的比例與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)。因此為了了解ATZ、Hrd1和細(xì)胞自噬體膜蛋白LC3在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1，并用NH4Cl抑制溶酶體酶活性，同時設(shè)立DMSO組作為對照，細(xì)胞爬片免疫染色。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示在氯化銨抑制溶酶體后，共表達(dá)ATZ和Hrd1可使細(xì)胞漿中的LC3-II發(fā)生大量的點(diǎn)狀聚集，且Hrd1可促進(jìn)ATZ與LC3共定位，提示Hrd1可能介導(dǎo)ATZ到達(dá)溶酶體中降解。 1.2自噬誘導(dǎo)和抑制對Hrd1介導(dǎo)ATZ降解的影響 為了進(jìn)一步確定Hrd1是否介導(dǎo)ATZ通過自噬途徑降解，我們在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1后，首先我們使用放線菌酮(cycloheximide, CHX)來阻斷ATZ蛋白的合成，再分別加入自噬誘導(dǎo)劑HBSS和自噬抑制劑巴佛洛霉素A1（BafilomycinA1，，BFA1），設(shè)立空載體對照，免疫印跡檢測細(xì)胞內(nèi)ATZ水平變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與DMSO組相比，饑餓誘導(dǎo)自噬后，Hrd1能夠顯著下調(diào)ATZ的蛋白水平；溶酶體抑制劑BFA1可部分抑制Hrd1的作用。 1.3抑制內(nèi)源性Hrd1表達(dá)對ATZ自噬降解的影響 293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1-siRNA，設(shè)立空載體對照，觀察內(nèi)源性Hrd1表達(dá)抑制后對ATZ自噬降解的影響。免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，抑制內(nèi)源性Hrd1的表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)ATZ水平增高。 1.4Hrd1對ATZ的自噬降解與其E3活性有關(guān) 為了進(jìn)一步明確Hrd1介導(dǎo)ATZ的自噬降解是否與其E3活性有關(guān)，我們分別將HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA，24hrs后在細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中加入BFA1，然后檢測細(xì)胞內(nèi)的ATZ水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hrd1C1A不能促進(jìn)ATZ的降解，加入BFA1后細(xì)胞內(nèi)ATZ水平也無明顯變化。提示Hrd1介導(dǎo)的ATZ自噬降解與其E3活性有關(guān)。 1.5Hrd1介導(dǎo)不溶性ATZ通過自噬降解 以前的研究發(fā)現(xiàn)Hrd1在降低ATZ總體水平的同時輕度增加SDS可溶性ATZ水平，顯著降低SDS不溶性和多聚體ATZ的水平，且有研究發(fā)現(xiàn)自噬通路主要降解ATZ的聚集體部分，據(jù)此我們推測Hrd1是否介導(dǎo)不溶性ATZ通過自噬通路降解。為了驗(yàn)證這一設(shè)想，我們用免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測細(xì)胞上清和沉淀中的ATZ，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hrd1能明顯降低沉淀中ATZ的水平，而加入NH4Cl后抑制了Hrd1介導(dǎo)的ATZ降解，該結(jié)果提示Hrd1可通過自噬通路介導(dǎo)不溶性ATZ降解。 1.6Hrd1對自噬相關(guān)基因Atg5，Atg12和Beclin-1的影響 通常情況下，細(xì)胞自噬的發(fā)生依賴于一系列Atg家族蛋白，其中Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳動物中的同源物，通過與Class Ⅲ PI3K形成復(fù)合物參與自噬體初期自噬體膜的形成；另外，Atg5在細(xì)胞內(nèi)形成Atg12-Atg5復(fù)合物，能促使LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)變，對自噬體膜的延伸至關(guān)重要。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Hrd1對自噬的影響，我們在HEK293T中共表達(dá)ATZ與Hrd1，提取RNA進(jìn)行real-timePCR檢測Atg5、Atg12以及Beclin1的mRNA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)ATZ和Hrd1明顯增加自噬相關(guān)基因Atg5、Atg12的mRNA水平，Beclin1水平也有所提高。 2Hrd1促進(jìn)ATZ K48位點(diǎn)泛素化 泛素是一個由76個氨基酸組成的高度保守的多肽鏈，因其廣泛分布于各類細(xì)胞而得名。泛素共價地結(jié)合于底物蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基，被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)將被特異性地識別并迅速降解。靶蛋白的泛素化降解是一個涉及E1泛素激活酶，E2泛素結(jié)合酶，以及E3泛素連接酶的酶促反應(yīng)。一個泛素分子內(nèi)部的七個賴氨酸殘基（K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63）之一和前面的泛素分子形成一個多聚泛素鏈。不同的泛素化連接方式有不同的生物學(xué)功能，例如K48連接的多泛素鏈介導(dǎo)泛素化靶蛋白進(jìn)行蛋白酶體降解，K63連接的多泛素化最近已經(jīng)顯示出參與多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞內(nèi)吞作用，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和DNA損傷的調(diào)節(jié)等與蛋白酶體無關(guān)的作用。為了探究Hrd1介導(dǎo)ATZ的泛素化方式，HEK293T共轉(zhuǎn)染Hrd1和ATZ，加入自噬抑制劑BFA1，免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示Hrd1和ATZ可以與K48共定位，而與K63無共定位。免疫共沉淀結(jié)果提示ATZ與Hrd1以及K48可能存在相互作用，Hrd1可能促進(jìn)ATZ的K48位泛素化。 3. p62參與Hrd1介導(dǎo)的ATZ的自噬通路降解 3.1Hrd1與ATZ及p62共定位 p62是自噬發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用的蛋白。大量研究結(jié)果表明：泛素化的蛋白能夠通過p62的UBA結(jié)構(gòu)域與p62發(fā)生結(jié)合，而p62又可通過其自身的LIR區(qū)域與自噬體膜蛋白LC3直接相互作用形成三者的復(fù)合物，并由LC3轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬體，最后通過自噬體/溶酶體降解，p62本身也能被自噬降解，故p62可作為自噬活性的標(biāo)志分子。前述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)Hrd1可以泛素化ATZ，我們想知道泛素化的ATZ是否與p62相互作用。首先我們在293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd1，24hrs后加入自噬抑制劑BFA1，6hrs后固定細(xì)胞，免疫熒光染色標(biāo)記ATZ、Hrd1和p62三種蛋白，激光共聚焦顯微鏡觀察三者在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，結(jié)果顯示三者在細(xì)胞內(nèi)共定位。 3.2ATZ與p62相互作用 為了進(jìn)一步證實(shí)Hrd1、ATZ與p62之間的相互作用，293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATZ和Hrd124hrs后，加入自噬抑制劑BFA1，6hrs后收集細(xì)胞裂解，免疫沉淀AAT后免疫印跡觀察p62與ATZ的相互作用，結(jié)果顯示ATZ與p62存在相互作用。結(jié)論Hrd1可介導(dǎo)ATZ K48位點(diǎn)泛素化，促進(jìn)泛素化的ATZ與p62的相互作用識別并結(jié)合，從而促進(jìn)自噬體中溶酶體途徑介導(dǎo)的ATZ降解。
【關(guān)鍵詞】：α1抗胰蛋白酶 Z型突變體 自噬 Hrd1 p62 LC3
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-8
• 中文摘要8-13
• ABSTRACT13-19
• 1 前言19-20
• 2 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.1 菌株及細(xì)胞株20
• 2.2 質(zhì)粒20
• 2.3 抗體20-21
• 2.4 主要試劑21
• 2.5 引物和 siRNA21
• 2.6 主要儀器和設(shè)備21-22
• 3 實(shí)驗(yàn)方法22-32
• 3.1 主要試劑溶液的配方22-24
• 3.2 質(zhì)粒中抽24-25
• 3.3 siRNA 的合成25-26
• 3.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染26
• 3.5 免疫印跡26-28
• 3.6 real time-PCR28-30
• 3.7 CHX 示蹤實(shí)驗(yàn)30
• 3.8 蛋白酶體抑制實(shí)驗(yàn)30-31
• 3.9 自噬誘導(dǎo)及其檢測31
• 3.10 自噬抑制及其檢測31
• 3.11 免疫細(xì)胞染色31-32
• 3.12 免疫共沉淀32
• 4 結(jié)果32-44
• 4.1 自噬參與 Hrd1 介導(dǎo)的 ATZ 降解32-39
• 4.1.1 Hrd1 促進(jìn) ATZ 與自噬體膜蛋白 LC3 共定位32-33
• 4.1.2 自噬誘導(dǎo)和抑制分別對 Hrd1 介導(dǎo) ATZ 降解的影響33-35
• 4.1.3 抑制內(nèi)源性 Hrd1 表達(dá)對 ATZ 自噬降解的影響35-36
• 4.1.4 Hrd1 對 ATZ 的自噬降解與其 E3 活性有關(guān)36-37
• 4.1.5 Hrd1 主要介導(dǎo)不溶性 ATZ 通過自噬降解37-38
• 4.1.6 共表達(dá) Hrd1 和 ATZ 對 Atg5，Atg12 和 Beclin1 的影響38-39
• 4.2 Hrd1 促進(jìn) ATZ K48 位點(diǎn)泛素化39-42
• 4.3 p62 參與 Hrd1 介導(dǎo) ATZ 的自噬通路降解42-44
• 4.3.1 Hrd1 與 ATZ 及 p62 共定位42
• 4.3.2 ATZ 與 p62 相互作用42-44
• 5 討論44-47
• 6 結(jié)論47
• 7 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)47-48
• 8 參考文獻(xiàn)48-52
• 附錄52-54
• 致謝54-55
• 綜述55-65
• 參考文獻(xiàn)61-65

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：921948