本文關(guān)鍵詞：人工誘導(dǎo)空腸彎曲菌紅霉素耐藥株的生物學(xué)特性及蛋白質(zhì)組學(xué)分析

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【摘要】：空腸彎曲菌'Campylobacter jejuni)是重要的人獸共患病原菌,能引起人的腹瀉性腸炎。在少數(shù)情況下,空腸彎曲菌的感染會導(dǎo)致格林-巴利綜合癥。大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素是治療空腸彎曲菌病的首選藥物。但隨著紅霉素的廣泛使用,空腸彎曲菌對紅霉素耐藥率不斷升高,空腸彎曲菌紅霉素的耐藥性已成為一個重要的臨床問題。因此,研究和克服空腸彎曲菌對紅霉素的耐藥性問題,探索和發(fā)現(xiàn)其耐藥機制,對研發(fā)低毒、高效、選擇性強的抗菌藥物具有重要意義。 隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,空腸彎曲菌紅霉素的耐藥機制研究取得了一些進展,但還不能完全來解釋空腸彎曲菌紅霉素耐藥的形成�？漳c彎曲菌對紅霉素耐藥性的獲得是多層次多基因水平的變異積累過程,所以可以從整體水平上分析空腸彎曲菌紅霉素耐藥相關(guān)蛋白的表達,鑒定并了解其功能。 本研究的目的是：(1)建立體外誘導(dǎo)空腸彎曲菌紅霉素耐藥株的方法,分析耐藥基因的突變對空腸彎曲菌紅霉素耐藥株生理特性的影響。(2)利用二維電泳技術(shù)分析比較空腸彎曲菌紅霉素耐藥株與其親本敏感株的蛋白質(zhì)組學(xué)特性,尋找空腸彎曲菌紅霉素耐藥株可能的耐藥相關(guān)蛋白。 一、空腸彎曲菌紅霉素耐藥株的誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性的研究 本研究通過將空腸彎曲菌紅霉素敏感株在紅霉素梯度平板上不斷地傳代篩選,最終獲得7株空腸彎曲菌紅霉素耐藥株RGXY122R、d-2-3R、C31-10R、SO-12-5R、PO-13-9R、PO-19-5R、11168R。測定這7株耐藥株的穩(wěn)定性、生化反應(yīng)和藥敏,結(jié)果顯示誘導(dǎo)的耐藥株在無抗的平板上傳30代后,仍能生長于高濃度紅霉素的平板上,且耐藥性的改變對該菌代謝方面沒有顯著的影響；空腸彎曲菌紅霉素耐藥性獲得后,不影響其對青霉素類、頭孢菌素類、喹諾酮類、四環(huán)素類及氨基糖苷類抗生素的耐藥性。建立了可靠的體外誘導(dǎo)空腸彎曲菌紅霉素耐藥株的模型。 對空腸彎曲菌人工誘導(dǎo)紅霉素耐藥株和天然耐藥株的耐藥基因和外排泵的檢測結(jié)果顯示,誘導(dǎo)耐藥株RGXY122R、d-2-3R、C31-10R發(fā)生了23S rRNA基因的突變,SO-12-5R、 PO-13-9R、PO-19-5R、11168R同時發(fā)生了rplD和rplV基因的突變,而天然耐藥株則只發(fā)生23S rRNA基因的突變。誘導(dǎo)耐藥株23S rRNA基因的突變在2074位點,而天然耐藥則在2075位點。誘導(dǎo)耐藥和天然耐藥都不發(fā)生cmeB基因的突變。外排泵都能降低誘導(dǎo)耐藥株與天然耐藥株對紅霉素的耐藥性。這一結(jié)果表明空腸彎曲菌紅霉素誘導(dǎo)耐藥株比天然耐藥株具有多樣、復(fù)雜的耐藥機制。 將誘導(dǎo)空腸彎曲菌產(chǎn)生紅霉素耐藥性的傳代次數(shù)及耐藥株的來源、藥敏、毒力和增殖能力與耐藥基因的突變類型結(jié)合分析顯示空腸彎曲菌禽源株傾向于發(fā)生23S rRNA基因突變,而人源株則傾向于發(fā)生rplD和rplV基因的突變。23S rRNA基因的突變能產(chǎn)生高水平的耐藥,但其對人腸上皮細胞Caco-2和雞巨噬細胞HD-11的黏附侵襲率及在雞巨噬細胞HD-11中增殖能力是下降的,同時23S rRNA基因的突變還能引起克林霉素的耐藥。而rplD和rplV基因能引起低水平的紅霉素耐藥,增殖能力降低。 二、空腸彎曲菌紅霉素誘導(dǎo)耐藥株與其親本敏感株的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究 本研究通過丙酮-三氯醋酸沉淀法提取空腸彎曲菌紅霉素誘導(dǎo)耐藥株11168R與其親本敏感株11168的菌體蛋白。用7cm pH3-10的膠條進行二維電泳發(fā)現(xiàn)蛋白點主要集中于pH4-7之間,在用17cm pH4-7的膠條重復(fù)進行3次二維電泳,PDQust8.0軟件分析,大約共鑒定出500個蛋白點,其中9個在耐藥株中是上調(diào)的,2個下調(diào)。這11個差異蛋白點經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定,將11個鑒定成功的蛋白進行功能分類,分別有5個能量代謝相關(guān)蛋白、3個毒力相關(guān)蛋白、2個轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白及1個生物合成相關(guān)蛋白。能量代謝相關(guān)蛋白上調(diào)說明空腸彎曲菌在耐藥形成過程中,對能量的需求增加；毒力相關(guān)蛋白上調(diào),說明空腸彎曲菌獲得紅霉素耐藥后,毒力增加。其中GalU、Enolase、NusG、FusA蛋白經(jīng)STRING9.05軟件分析能與核糖體蛋白相互作用,是可能的耐藥相關(guān)蛋白。通過熒光定量PCR驗證二維電泳,結(jié)果顯示除了fumC和fba基因在mRNA水平上無明顯差異,其余基因在mRNA水平表達差異與二維電泳結(jié)果一致。
【關(guān)鍵詞】：空腸彎曲菌 紅霉素耐藥 誘導(dǎo)耐藥 二維電泳 耐藥相關(guān)蛋白
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.3;R3411
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-7
• 目錄7-8
• 符號說明8-9
• 綜述 空腸彎曲菌的紅霉素耐藥機制及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展9-19
• 1 空腸彎曲菌紅霉素的耐藥現(xiàn)狀9-10
• 2 空腸彎曲菌對紅霉素的耐藥機制10-11
• 3 空腸彎曲菌特異突變位點改變的檢測11-12
• 4 空腸彎曲菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀12-14
• 5 總結(jié)和展望14-15
• 參考文獻15-19
• 第一章 空腸彎曲菌紅霉素耐藥株的誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性的研究19-38
• 1 材料和方法19-23
• 2 結(jié)果23-32
• 3 討論32-35
• 參考文獻35-38
• 第二章 空腸彎曲菌紅霉素誘導(dǎo)耐藥株與親本敏感株的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究38-59
• 1 材料和方法38-48
• 2 結(jié)果48-54
• 3 討論54-57
• 參考文獻57-59
• 致謝59-60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：921403