本文關(guān)鍵詞：MPLexon10基因新突變體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

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【摘要】：目的： 通過構(gòu)建野生型及突變型MPL exon10基因的慢病毒表達(dá)載體,包裝含有各目的基因片段的慢病毒,為后續(xù)研究MPL exon10新基因突變體MPLA497-L498LVIAins的功能奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.構(gòu)建MPLA497-L498LVIA ins及對照基因的真核表達(dá)載體 應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增MPL exon10新基因突變體(MPLA497-L498LVIA ins)及野生型MPL (MPLWT)的全長CDS編碼區(qū)域,分別通過酶切、連接反應(yīng),構(gòu)建其慢病毒表達(dá)載體并依次命名為pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins及pCDH1-MPLWT重組質(zhì)粒。以pCDH1-MPLWT的重組質(zhì)粒為模板,通過定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)建MPL熱點(diǎn)突變體(MPLW515L)表達(dá)載體,并命名為pCDHl-MPLW515L重組質(zhì)粒。 2.構(gòu)建MPLA497-L498LVIA ins及對照基因的慢病毒表達(dá)體系 采用最佳的質(zhì)粒配比比例,將構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV和pVSV-G通過磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝慢病毒顆粒,用激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率。 3.慢病毒感染293T細(xì)胞,測定病毒滴度 收集的慢性毒濃縮液分梯度直接感染293T細(xì)胞,于96小時激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá),計(jì)數(shù)最后一個能觀察到熒光的孔內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù),按公式計(jì)算病毒滴度(TU/ml)-最后一孔熒光細(xì)胞數(shù)/稀釋倍數(shù)×103。 結(jié)果： 1.經(jīng)酶切,測序鑒定,慢病毒表達(dá)載體pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins、 pCDH1-MPLW515L和pCDH1-MPLWT重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.利用基因工程技術(shù)構(gòu)建三種目的基因的慢病毒表達(dá)體系,經(jīng)激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)轉(zhuǎn)染效率分別pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins為75.2%、pCDH1-MPLW515L為81.4%和pCDH1-MPLWT為69.9%,三種慢病毒表達(dá)體系成功構(gòu)建。 3.測定病毒滴度分別為MPLA497-L498LVIA ins4×108TU/ml, MPLW515L4×109TU/ml, MPLWT1×106TU/ml,滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。 結(jié)論： 本課題設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建MPLexon10新突變體-MPLA497-L498LVIA ins,熱點(diǎn)突變MPLW515L及MPL野生型的慢病毒表達(dá)載體；建立了成熟的慢病毒包裝技術(shù),其所產(chǎn)生的病毒滴度較高,可以滿足后續(xù)該新突變在細(xì)胞株以及小鼠模型功能實(shí)驗(yàn)研究。
【關(guān)鍵詞】：MPL exon10突變 MPLA497-L498LVIAins MPLW515L 慢病毒載體 轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 材料與方法11-26
• 結(jié)果26-39
• 討論39-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-45
• 綜述45-55
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 個人簡介55-56
• 致謝56-57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 羅師平,冷希崗;基于PCR的體外誘變技術(shù)[J];國外醫(yī)學(xué)(生物醫(yī)學(xué)工程分冊);2005年03期

2 王淑艷;張愚;;慢病毒載體的設(shè)計(jì)及應(yīng)用進(jìn)展[J];中國生物工程雜志;2006年11期

3 劉柳;肖志堅(jiān);;骨髓增殖性腫瘤發(fā)病分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2011年01期

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本文編號：914648