本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白17的生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)及重組蛋白的免疫保護(hù)性研究

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【摘要】：目的 用生物信息學(xué)方法分析剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白17（TgROP17）的結(jié)構(gòu)特性與抗原表位；克隆表達(dá)TgROP17基因，并對(duì)重組剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白17（rTgROP17）進(jìn)行純化和抗原性分析；觀察不同劑量rTgROP17滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；觀察最佳劑量rTgROP17抗弓形蟲(chóng)感染的保護(hù)作用；探討rTgROP17作為弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原的可能性。 材料與方法 第一部分：利用生物信息學(xué)在線(xiàn)分析程序并結(jié)合Gene Runner和DNAMAN軟件分析預(yù)測(cè)TgROP17的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、可溶性、蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和T細(xì)胞、B細(xì)胞抗原表位。 第二部分：提取弓形蟲(chóng)RH株速殖子總RNA，根據(jù)TgROP17基因的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物并引入Bam H I和Xho I酶切位點(diǎn)，RT-PCR擴(kuò)增出目的基因經(jīng)雙酶切后連接入pGEX-6P-1載體中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌（E. coli）DH5α，陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。將重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-TgROP17轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta（DE3）并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用GST-親和層析柱純化目的蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)純化產(chǎn)物。Western blotting鑒定重組蛋白及其抗原性。 第三部分：40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，分別用15μg、25μg、35μg、45μg rTgROP17溶于20μl無(wú)菌PBS中滴鼻免疫小鼠，對(duì)照組用20μl PBS代替，于第0、14、21天各免疫1次。末次免疫后第14天，眼靜脈叢采血并分離血清。收集鼻咽、陰道和小腸沖洗液，ELISA法檢測(cè)以上沖洗液SIgA和血清IgG及其亞型。無(wú)菌取脾，培養(yǎng)rTgROP17或ConA刺激后的脾淋巴細(xì)胞，CCK-8法測(cè)定刺激指數(shù)(SI)。ELISA法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的含量。 第四部分：BALB/c小鼠40只隨機(jī)分為2組，35μg rTgROP17溶于20μl無(wú)菌PBS中，于第0、14、21天各滴鼻免疫小鼠一次，對(duì)照組用等量PBS代替。末次免疫后第14天，分別用1×104速殖子（慢性感染，免疫組和對(duì)照組各8只）或4×104速殖子（致死性感染，免疫組和對(duì)照組各12只）灌胃攻擊每只小鼠。觀察和記錄致死性感染小鼠30天內(nèi)健康狀況和存活情況。攻蟲(chóng)后30天，頸椎脫臼處死慢性感染小鼠，分離計(jì)數(shù)肝、腦組織內(nèi)速殖子數(shù)。 結(jié)果 第一部分：TgROP17是由608個(gè)氨基酸組成的可溶性蛋白，理論等電點(diǎn)為9.55，分子量為69056.2，分子式為C3087H4879N889O875S19，半衰期為30h，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，有8個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)，存在24個(gè)B細(xì)胞抗原表位，23個(gè)CTL細(xì)胞表位，24個(gè)Th細(xì)胞表位。 第二部分：RT-PCR擴(kuò)增得到約為1850bp的產(chǎn)物,并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-TgROP17。SDS-PAGE結(jié)果顯示，表達(dá)純化后獲得相對(duì)分子量（Mr）約96kDa的可溶性重組蛋白。Western blotting結(jié)果顯示，rTgROP17為帶GST標(biāo)簽的重組蛋白，且能被兔抗弓形蟲(chóng)血清識(shí)別。 第三部分：25μg、35μg和45μg組血清IgG以及小腸、鼻咽和陰道沖洗液SIgA含量均顯著高于對(duì)照組（P0.05或P0.01），其中35μg組最高；且各組血清IgG2水平較IgG1水平高。與對(duì)照組相比，25μg、35μg和45μg組脾淋巴細(xì)胞SI顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05或P0.01）。25μg、35μg和45μg組細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-2含量均顯著高于對(duì)照組（P0.05或P0.01），35μg組最高；35μg和45μg組IL-4含量高于對(duì)照組（P0.05）；IL-5含量各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 第四部分：慢性感染實(shí)驗(yàn)組肝組織和腦組織內(nèi)蟲(chóng)荷（49.42±9.15×105/g和9.63±1.64×105/g）均顯著低于對(duì)照組（120.62±16.7×105/g和18.91±3.24×105/g）（P0.01），，減蟲(chóng)率分別為59.17%和49.08%。致死性感染實(shí)驗(yàn)組30天生存率達(dá)75%，而PBS對(duì)照組小鼠為25%，兩者生存曲線(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 結(jié)論 生物信息學(xué)分析顯示剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白17（TgROP17）具有多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位；我們成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-TgROP17，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得重組剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白17（rTgROP17），證實(shí)了rTgROP17具有抗原性。rTgROP17滴鼻免疫小鼠有效誘導(dǎo)了黏膜免疫應(yīng)答及系統(tǒng)免疫應(yīng)答，35μg劑量組效果最佳。rTgROP17可有效誘導(dǎo)抗弓形蟲(chóng)感染的保護(hù)作用,是有前景的弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原。
【關(guān)鍵詞】：剛地弓形蟲(chóng) 棒狀體蛋白17 生物信息學(xué) 基因克隆 重組蛋白 滴鼻免疫 黏膜疫苗 免疫保護(hù)性
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R382.5;R3416
【目錄】：

• 縮略詞7-9
• 摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 第一章 剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白 2 家族疫苗候選分子的研究進(jìn)展16-31
• 摘要16
• 引言16-17
• 1 棒狀體蛋白 2（ROP2）17-19
• 2 棒狀體蛋白 4（ROP4）19-20
• 3 棒狀體蛋白 5（ROP5）20-21
• 4 棒狀體蛋白 8（ROP8）21-22
• 5 棒狀體蛋白 13（ROP13）22
• 6 棒狀體蛋白 16（ROP16）22
• 7 棒狀體蛋白 17（ROP17）22-23
• 8 棒狀體蛋白 18（ROP18）23-24
• 結(jié)語(yǔ)24
• 參考文獻(xiàn)24-31
• 第二章 剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白 17（TGROP17）主要特性和抗原表位的生物信息學(xué)分析31-45
• 摘要31-32
• 前言32-33
• 材料和方法33
• 結(jié)果33-40
• 討論40-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 第三章 剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白 17（TGROP17）基因的克隆表達(dá)、純化及免疫反應(yīng)性分析45-61
• 摘要45-46
• 前言46-47
• 材料和方法47-54
• 結(jié)果54-58
• 討論58
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 第四章 重組剛地弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白 17（RTGROP17）滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答61-75
• 摘要61-63
• 前言63-64
• 材料和方法64-68
• 結(jié)果68-71
• 討論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-75
• 第五章 重組弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白 17（RTGROP17）滴鼻免疫小鼠抗弓形蟲(chóng)感染的保護(hù)作用75-84
• 摘要75-76
• 前言76-77
• 材料與方法77-79
• 結(jié)果79-80
• 討論80-81
• 參考文獻(xiàn)81-84
• 附錄Ⅰ84-87
• 主要試劑的配制84-87
• 附錄Ⅱ87-88
• ELISA 主要試劑溶液配制方法87-88
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況88-89
• 致謝89-90
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷90

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：914547