本文關(guān)鍵詞：人分泌性白細胞蛋白酶抑制劑在果蠅細胞中的穩(wěn)定表達及鑒定

  更多相關(guān)文章： 人SLPI 果蠅表達系統(tǒng) 穩(wěn)定表達 生物學活性

【摘要】：目的：人分泌性白細胞蛋白酶抑制劑（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）也叫抗白細胞蛋白酶（antileukoprotease, ALP）或分泌性蛋白酶抑制劑（mucousprotease inhibitor, MPI），為黏膜上皮細胞分泌的非糖基化單鏈多肽蛋白，是一種嗜中性彈性蛋白酶陽離子抑制劑，具有抗細菌、抗人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiency virus, HIV）、抗炎癥因子和誘導細胞增殖分化等生物學功能，對創(chuàng)傷組織的愈合也具有重要作用。近來，作為一種潛在的黏膜佐劑，人SLPI在增強黏膜免疫方面的作用引起人們的關(guān)注，因此，我們想應用果蠅表達系統(tǒng)，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方式篩選出能穩(wěn)定表達人SLPI蛋白的多克隆細胞系，并對其生物學活性進行初步鑒定，為進一步開展了解人SLPI在抗病毒感染及其免疫佐劑等方面的作用奠定基礎(chǔ)。 方法：首先從A549細胞中提取細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)人SLPI基因序列，設計上、下游兩個引物，并分別加入KpnⅠ和EcoRⅠ兩個酶切位點。利用PCR技術(shù)，以A549的cDNA為模板擴增SLPI的開放讀碼框（open readingframe, ORF）。然后利用DNA重組技術(shù)將PCR基因產(chǎn)物克隆入果蠅S2細胞表達載體pMT/V5-HisA中，得到pMT-SLPI真核表達載體。應用磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)將pMT-SLPI與含有潮霉素B抗性基因的篩選質(zhì)粒pCoHygro以共轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染S2細胞，然后用含有300g/ml潮霉素B的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每4-5d更換抗性培養(yǎng)液，大約3-4周便可產(chǎn)生抗性細胞克隆。對克隆細胞加入終濃度為500M的CuSO4誘導表達48h后，收集細胞上清行Western blot檢測重組蛋白的表達。并利用RT-PCR的方法檢測SLPI在克隆細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平。對不同誘導時間后的細胞上清進行Western blot檢測以確定誘導的最佳時間。誘導后的細胞上清濃縮后行胰蛋白酶抑制實驗，以觀察果蠅S2細胞表達的重組蛋白是否具有良好的生物學活性。 結(jié)果：采用RT-PCR技術(shù)從A549細胞中得到人SLPI基因ORF，通過EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切位點將人SLPI基因ORF序列插入到表達載體中，成功構(gòu)建了人SLPI的真核表達載體。與抗性篩選質(zhì)粒pCoHygro共轉(zhuǎn)染S2細胞后在含有潮霉素的培養(yǎng)液中篩選3-4周，得到能穩(wěn)定表達人SLPI蛋白的多克隆細胞系，并命名為S2/SLPI。應用CuSO4對S2/SLPI進行誘導并對誘導后的細胞上清通過Western blot檢測，可得到大小為12kDa左右的特異性條帶，證實目的蛋白的表達，并通過對不同誘導時間段的細胞上清行Western blot檢測，確定誘導該蛋白的最佳時間為24h。生物學活性分析顯示人SLPI能抑制胰蛋白酶的活性。 結(jié)論：利用RT-PCR方法成功克隆了人SLPI基因ORF，并利用果蠅表達系統(tǒng)篩選到可分別穩(wěn)定表達人SLPI蛋白的多克隆細胞株。S2/SLPI穩(wěn)定表達細胞株的建立為進一步開展人SLPI促進免疫應答及其在抗病毒感染等方面的作用研究提供了重要基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人SLPI 果蠅表達系統(tǒng) 穩(wěn)定表達 生物學活性
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 實驗設計與流程11-12
• 前言12-15
• 實驗材料15-19
• 實驗方法19-30
• 結(jié)果30-36
• 討論36-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻38-41
• 附錄41-42
• 致謝42-43
• 綜述43-50
• 參考文獻48-50

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳朝棟,高建恩,陶其敏;在哺乳動物細胞中穩(wěn)定表達丙型肝炎病毒E2糖蛋白[J];中國生物化學與分子生物學報;1998年01期

2 吳健敏，董海濤，，余應年，朱麗君;CYP2B6cDNA導入V79、FL和CHL細胞中穩(wěn)定表達及其初步鑒定[J];癌變畸變突變;1995年04期

3 陳永井,施勤,徐寬楓,周斌,張學光;LacZ基因在哺乳動物細胞中的穩(wěn)定表達及其檢測方法[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);2002年06期

4 楊凡;劉朝奇;覃曉琳;李斌;韓鈺;;病毒負性調(diào)節(jié)因子在內(nèi)皮細胞穩(wěn)定表達細胞株的建立[J];生物技術(shù)通報;2010年04期

5 鄭立明;;黑腹果蠅平均壽命雄性大于雌性的現(xiàn)象及原因分析[J];中國老年學雜志;1992年05期

6 趙耀東;楊吉成;謝宇峰;盛偉華;張海峰;苗莉;繆競誠;;人腦源性神經(jīng)生長因子(hBDNF)基因在CHO細胞的穩(wěn)定表達及功能研究[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);2007年03期

7 覃曉琳;劉朝奇;任東明;韓莉;楊凡;;HIV-1 Nef基因在THP-1細胞的表達和活性檢測[J];免疫學雜志;2010年10期

8 竇肇華,胡衛(wèi)紅,張繼偉,尚保紅,樊榮;茶葉對果蠅壽命影響的實驗研究[J];中國老年學雜志;1988年06期

9 張玖,戴艷玲;金銀花及其水提物對果蠅耐熱能力的影響[J];中國野生植物資源;1997年03期

10 王楓,郭俊生;谷氨酸對果蠅熱耐力和Hsp70蛋白含量的影響[J];衛(wèi)生研究;1998年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 許君;丘志娟;鄧菲;胡志紅;王華林;;熒光定量PCR檢測穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒的細胞系中和病人血清中的共價閉合環(huán)狀DNA[A];“環(huán)境與健康”學術(shù)研討會論文摘要集[C];2007年

2 侯琦;;二苯乙烯低聚體Vam3對Ceramide誘導的穩(wěn)定表達GFP-Bax人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響[A];全國生化與分子藥理學藥物靶點研討會論文摘要集[C];2008年

3 栗向東;胡蘊玉;;人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因轉(zhuǎn)染成纖維細胞后的穩(wěn)定表達和誘導成骨的實驗研究[A];加入WTO和中國科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機遇、責任和對策（下冊）[C];2002年

4 曲會;李素;郭煥成;趙福廣;涂長春;;CSFV E2逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定表達哺乳動物細胞系的建立[A];第四屆中國畜牧科技論壇論文集[C];2009年

5 朱振華;;基于真核表達的F1抗原的間接免疫熒光法檢測鼠疫桿菌F1抗體的實驗研究[A];第二屆全國人畜共患病學術(shù)研討會論文集[C];2008年

6 趙志敬;王曉斌;劉毅;孫冬冬;李志超;王海昌;董明清;;人心房肌Kvl.5鉀通道穩(wěn)定表達細胞系的建立及糖基化修飾[A];中華醫(yī)學會第11次心血管病學術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

7 楊德林;宋波;王劍松;張超;徐鴻毅;;具有高侵襲力和高穩(wěn)定表達GFP的膀胱癌細胞的獲得[A];第十五屆全國泌尿外科學術(shù)會議論文集[C];2008年

8 王國權(quán);趙忠新;邵福源;;穩(wěn)定表達TrkA的Cos-7細胞株在NGF刺激下與分化相關(guān)的蛋白質(zhì)組學研究[A];中華醫(yī)學會第七次全國神經(jīng)病學學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

9 汪宇輝;胡麗娟;葉珊;王正榮;;PER1干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其在SH-SY5Y細胞中的穩(wěn)定表達[A];2004全國時間生物醫(yī)學學術(shù)會議論文集[C];2004年

10 原江水;馮永堂;王菲;宮偉雁;邸大琳;任杰;苗乃法;;小鼠OX40穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建及其對B細胞促分化作用的研究[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術(shù)會議資料匯編[C];2008年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 任荃;年過半百戀上果蠅[N];文匯報;2003年

2 記者 張可喜;果蠅也有生物鐘[N];新華每日電訊;2001年

3 記者 何德功;日發(fā)現(xiàn)利于長壽蛋白質(zhì)[N];新華每日電訊;2004年

4 何德功;“MBF1”蛋白質(zhì)利于長壽[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

5 ;研究發(fā)現(xiàn)“我還沒有死”基因使果蠅長壽[N];科技日報;2002年

6 本報記者 田泓;裝修多污染從簡是上策[N];人民日報;2003年

7 記者 曹麗君;科學家發(fā)現(xiàn)新果蠅物種[N];人民日報;2005年

8 本報記者 沈英甲;基因 人比果蠅也許只多2萬個[N];科技日報;2001年

9 趙;美利用果蠅研究瘧疾獲新進展[N];國際經(jīng)貿(mào)消息;2000年

10 黃中;基因研究中的功臣：果蠅[N];中國知識產(chǎn)權(quán)報;2000年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 卜秀娟;蚓激酶表達產(chǎn)物活性在動物體內(nèi)的檢測[D];吉林大學;2007年

2 梁慧芳;TNFRIBP-Fc融合蛋白治療肥胖相關(guān)的胰島素抵抗及其機制的研究[D];華中科技大學;2007年

3 尹雪茜;人精子膜蛋白YWK-Ⅱ蛋白/APLP2與穆勒氏管抑制性物質(zhì)（MIS）的相互作用及其信號傳導通路[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2004年

4 趙琰;咪唑啉I_1受體穩(wěn)定表達系統(tǒng)的建立及其功能和信號轉(zhuǎn)導的初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2003年

5 劉定燮;SV40載體/COS7細胞穩(wěn)定表達系統(tǒng)的建立與改進[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2002年

6 馬丹;反義環(huán)氧合酶-2基因?qū)θ宋赴┘毎闟GC-7901侵襲力的影響[D];第三軍醫(yī)大學;2007年

7 劉孝菊;成纖維細胞生長因子23及其拮抗劑蛋白的基因克隆、表達與生物學活性研究[D];吉林大學;2012年

8 譚文彬;蚊核糖體蛋白L39基因克隆及初步功能的研究[D];南京醫(yī)科大學;2007年

9 郭紀鋒;突變型DJ-1蛋白對細胞線粒體功能、基因表達譜的影響和AREP基因型與表型分析[D];中南大學;2008年

10 李樹春;體內(nèi)生精系統(tǒng)重塑模型的建立及生精過程相關(guān)基因RSD-9功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2008年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 闞學通;人分泌性白細胞蛋白酶抑制劑在果蠅細胞中的穩(wěn)定表達及鑒定[D];安徽醫(yī)科大學;2013年

2 王建武;山羊重組促卵泡素（FSH）哺乳動物細胞內(nèi)瞬時和穩(wěn)定表達研究[D];揚州大學;2004年

3 賀俊;VEGF和BMP-7基因治療促進骨再生的初步研究[D];浙江大學;2006年

4 楊小華;可溶性TGFβⅡ型受體（sTGFβRⅡ）與人γ干擾素融合蛋白的表達及生物學活性鑒定[D];浙江大學;2004年

5 劉洋;穩(wěn)定表達鼠IFN-λ的CHO細胞系建立[D];江蘇大學;2009年

6 嚴正杰;重組長效山羊FSH基因在中國倉鼠卵巢細胞表達的研究[D];揚州大學;2005年

7 王樂;穩(wěn)定表達GFP-V12Rac1的NIH3T3細胞系的構(gòu)建[D];南京醫(yī)科大學;2010年

8 周雯;大蒜水提取物的生物活性研究[D];山東大學;2005年

9 汪淑晶;Caveolin-1在小鼠肝癌細胞Hepa1-6中的穩(wěn)定表達及其對細胞生長的影響[D];大連醫(yī)科大學;2006年

10 謝紅梅;雞傳染性支氣管炎S1基因在大腸桿菌中的表達及其生物活性的初步鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2006年

本文編號：897755