本文關(guān)鍵詞：模擬肝臟組織微環(huán)境對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的影響

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【摘要】：目的：體外條件下，采用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）。利用大鼠肝組織勻漿上清液（liver tissue homogenate supernatant, LHS）模擬肝臟組織微環(huán)境對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從細(xì)胞形態(tài)、肝細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin-18，CK-18）以及肝臟功能蛋白色氨酸2,3-加雙氧酶（tryptophan2,3-dioxygenase，TPH2）表達(dá)等方面考察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在肝臟組織微環(huán)境中向肝細(xì)胞定向分化的能力，以期為臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療終末期肝病提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。 方法： 1hUCMSCs的分離培養(yǎng)、表型及分化潛能鑒定 無菌條件下收集足月產(chǎn)胎兒的臍帶并儲存于0.9%的無菌生理鹽水中。在超凈工作臺內(nèi)用PBS洗去臍帶中殘余血液并剪為3-4cm的小段。沿縱軸剖開臍帶，暴露并剔除臍動脈和臍靜脈，分離臍帶基質(zhì)即華爾通膠（wharton’s jelly），將其剪為0.5-1.0mm~3的組織塊。采用組織塊培養(yǎng)法，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基10mL；置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80-90%匯合后吸棄組織塊，細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的第3代貼壁細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測hUCMSCs的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）標(biāo)志物的表達(dá)。取處于對數(shù)生長期的第3代貼壁細(xì)胞，消化收集，離心重懸，以2×10~4個/孔的密度接種于24孔板；分別采用成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，14天后分別采用Von Kossa染色法檢測鈣化基質(zhì)沉淀和油紅O染色法檢測脂滴。 2LHS誘導(dǎo)hUCMSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化 Sprague Dawley（SD）大鼠，2%戊巴比妥鈉按3mL/kg腹腔注射麻醉，固定四肢，消毒皮膚。打開腹腔，分離下腔靜脈和肝門靜脈，結(jié)扎肝門靜脈遠(yuǎn)端。從肝門靜脈近端進(jìn)針并固定，用4℃預(yù)冷的生理鹽水自肝門靜脈進(jìn)行肝臟灌流，待肝臟體積增大、肝葉變白時開放下腔靜脈以利于灌流液排出，共灌流約30min。灌流結(jié)束后取出肝組織置于冰上，剔除被膜及韌帶。稱取濕重，按150mg/mL加入DMEM/F12培養(yǎng)基；冰浴條件下進(jìn)行肝組織勻漿。4℃，，15000g離心30min，取上清液，0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-70℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?取處于對數(shù)生長期的第3代貼壁細(xì)胞，以1×105個/皿的細(xì)胞密度接種于直徑為35mm塑料培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至約80%匯合，吸棄培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（肝組織勻漿上清液）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。實驗分組為6組：陰性對照組、陽性對照組、標(biāo)準(zhǔn)對照組，LHS誘導(dǎo)hUCMSCs3天，5天，7天組；選取單純LHS作為陰性對照組，QSG-7701人肝細(xì)胞株作為陽性對照組，常規(guī)培養(yǎng)的hUCMSCs作為標(biāo)準(zhǔn)對照組。倒置顯微鏡下觀察并記錄各組細(xì)胞形態(tài)。提取上述各組細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR方法檢測肝細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin-18，CK-18）及肝臟功能蛋白色氨酸2,3-加雙氧酶（tryptophan2,3-dioxygenase，TPH2）的mRNA表達(dá)情況。 取處于對數(shù)生長期的第3代貼壁細(xì)胞，以5×105個/瓶的細(xì)胞密度接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組同上。提取上述各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定各組樣品的蛋白濃度。采用Westen blot方法檢測肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、CK-18及肝臟功能蛋白TPH2的表達(dá)情況。 3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 上述實驗均重復(fù)三次，統(tǒng)計結(jié)果以mean±SD表示；應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）繼以Dunnett t test對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計結(jié)果以P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1hUCMSCs的分離培養(yǎng)、表型及分化潛能鑒定 倒置顯微鏡下觀察，人臍帶基質(zhì)采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)10-14天，可見組織塊邊緣有長梭形的成纖維樣細(xì)胞長出；繼續(xù)培養(yǎng)7-10天細(xì)胞長至80%-90%匯合，呈漩渦狀或放射狀排列。 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：hUCMSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD105、CD73、CD90等MSCs表面標(biāo)志分子，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45及內(nèi)皮細(xì)胞特征性表面標(biāo)志分子CD31；也不表達(dá)人類白細(xì)胞抗原HLA-DR。表明hUCMSCs的免疫表型符合MSCs的免疫表型特征。 分化潛能鑒定結(jié)果顯示：hUCMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則形細(xì)胞，經(jīng)Von Kossa染色可見黑色鈣基質(zhì)沉淀。hUCMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)榉蚀蟮膱A梭形細(xì)胞，胞漿內(nèi)可見透亮脂滴，油紅O染色可見大量紅色透亮脂滴。表明hUCMSCs具有向骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能。 2LHS誘導(dǎo)hUCMSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化 倒置顯微鏡下觀察，hUCMSCs經(jīng)LHS誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后，梭形細(xì)胞開始減少，細(xì)胞兩極回縮，胞體變短；誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后，梭形細(xì)胞繼續(xù)減少，部分細(xì)胞呈三角形或多角形；誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，大多數(shù)細(xì)胞呈不規(guī)則形或類圓形，核大而圓，類似肝細(xì)胞形態(tài)。 肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、CK-18檢測結(jié)果顯示：與標(biāo)準(zhǔn)對照組相比，LHS誘導(dǎo)3天、5天、7天組AFP、CK-18在mRNA（RT-PCR）和蛋白質(zhì)（Westernblot）水平表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。其中，AFP的表達(dá)量在誘導(dǎo)5天時達(dá)到峰值，隨后下降；CK-18的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間延長而增加。 肝臟功能蛋白TPH2檢測結(jié)果顯示：與標(biāo)準(zhǔn)對照組相比，LHS誘導(dǎo)3天、5天、7天組TPH2在mRNA（RT-PCR）和蛋白質(zhì)（Western blot）水平表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.01），其表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間延長而增加。 結(jié)論： 1體外條件下，采用組織塊培養(yǎng)法可從人臍帶基質(zhì)中分離培養(yǎng)出具有MSCs生物學(xué)特征的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。 2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)肝組織勻漿上清液誘導(dǎo)能分化為具有肝細(xì)胞表面標(biāo)志物的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。 3人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)肝組織勻漿上清液誘導(dǎo)為肝細(xì)胞樣細(xì)胞后高表達(dá)肝臟功能蛋白，提示其具有肝細(xì)胞功能。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 誘導(dǎo) 分化 肝組織勻漿上清液 肝樣細(xì)胞 甲胎蛋白 細(xì)胞角蛋白18 色氨酸2 3-加雙氧酶
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-20
• 結(jié)果20-22
• 附圖22-28
• 附表28-29
• 討論29-32
• 結(jié)論32
• 參考文獻(xiàn)32-36
• 綜述 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究進(jìn)展36-49
• 參考文獻(xiàn)43-49
• 致謝49-50
• 個人簡歷50

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 王忠瓊;李昌平;杜光紅;鐘曉琳;陳霞;;多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年21期

2 陳軍;劉玉俠;姜文華;韓光;姜文平;;體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞的分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年49期

3 王憲英;吳紅海;秦亞斌;侯艷寧;;腦組織勻漿誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞[J];中國老年學(xué)雜志;2012年07期

4 張世昌;王英杰;劉濤;李桂清;;臍帶組織來源基質(zhì)干細(xì)胞的肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物分析[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2009年09期

本文編號：893374