本文關(guān)鍵詞：重組人腸三葉因子對腸上皮細(xì)胞移行能力的影響及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的：觀察重組人腸三葉因子(recombinant human intestinal trefoil factor, rhITF)對腸上皮細(xì)胞移行能力的影響并探討其作用機(jī)制。 方法： 1.實驗用藥：采用本實驗室重組表達(dá)的人腸三葉因子(rhITF)作為細(xì)胞刺激藥物，該重組蛋白純度達(dá)到98%以上，符合臨床前藥物研究標(biāo)準(zhǔn)。 2.細(xì)胞模型：以傳代培養(yǎng)的人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株為研究模型，購置于中科院細(xì)胞所，鑒定正確后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，再將傳至第5-10代的細(xì)胞用于實驗。 3.實驗分組：根據(jù)實驗?zāi)康牟煌�，本實驗采用多個分組模式，涉及的實驗組包括：(1)陰性對照組和不同濃度的rhITF組；(2)正常對照組、用藥3h組、6h組、12h組和24h組；(3)正常對照組、rhITF組和rhITF+抑制劑組；(4)陰性對照組、rhITF組和rhITF+抑制劑組。 4.培養(yǎng)條件：(1)陰性對照組：DMEM培養(yǎng)液；rhITF組：撤掉血清后分別給予10μg/ml rhITF、25μg/ml rhITF和50μg/ml rhITF；(2)正常對照組：DMEM培養(yǎng)液+10%小牛血清；不同時相點組：固定rhITF濃度為50μg/ml，分為3h、6h、12h和24h組；(3)正常對照組：同(2)；rhITF組：50μg/ml rhITF；rhITF+抑制劑組：50μg/ml rhITF+50μg/ml染料木黃酮；(4)陰性對照組：DMEM培養(yǎng)液；撤掉血清后分別加入50μg/ml rhITF和50μg/ml rhITF+50μg/ml染料木黃酮。 5.檢測指標(biāo)： (1)細(xì)胞移行：采用Transwell法，觀察腸上皮細(xì)胞移行能力的變化。 (2)黏附分子細(xì)胞定位和熒光表達(dá)：采用免疫熒光法檢測黏附分子β-Catenin和E-Cadherin在腸上皮細(xì)胞的定位和熒光表達(dá)情況。 (3)黏附分子含量：采用Western Blot法觀察黏附蛋白β-Catenin和E-Cadherin的蛋白表達(dá)變化。 (4)黏附分子磷酸化水平檢測：采用Western Blot法檢測磷酸化β-Catenin的蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果 1. rhITF促細(xì)胞移行能力隨其濃度的增加而增強(qiáng)。50μg/ml rhITF組細(xì)胞數(shù)明顯高于陰性對照組、10μg/ml rhITF組和25μg/ml rhITF組，，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；25μg/ml rhITF組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而10μg/ml rhITF組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 2.β-Catenin和E-Cadherin熒光表達(dá)和蛋白表達(dá)均受到rhITF抑制，與正常對照組、3h組、6h組和24h組比較，12h組熒光表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯減弱(P＜0.05)。 3.在rhITF的刺激下，與正常對照組、3h組、6h組和24h組比較，12h組磷酸化β-Catenin的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。 4.在rhITF和抑制劑（染料木黃酮）刺激下，rhITF組磷酸化β-Catenin的蛋白表達(dá)強(qiáng)于正常對照組和rhITF+抑制劑組(P0.05)。 5.抑制β-Catenin磷酸化后能明顯降低rhITF促進(jìn)細(xì)胞移行的能力。rhITF組細(xì)胞數(shù)顯著高于陰性對照組和rhITF+抑制劑組(P＜0.01)，而rhITF+抑制劑組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1．ITF具有促進(jìn)腸上皮細(xì)胞移行的能力。 2．ITF通過抑制細(xì)胞間黏附分子β-Catenin與E-Cadherin的表達(dá)，降低細(xì)胞間黏附力，促進(jìn)細(xì)胞移行。 3．ITF促進(jìn)細(xì)胞移行的核心機(jī)制是使β-Catenin磷酸化，削弱β-Catenin和E-Cadherin交聯(lián)，干擾細(xì)胞間黏附，從而促進(jìn)細(xì)胞移行。
【關(guān)鍵詞】：腸三葉因子 腸上皮細(xì)胞 細(xì)胞移行 黏附分子 β-Catenin E-Cadherin 磷酸化
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 一、材料試劑及主要儀器12-17
• （一） 細(xì)胞株和病毒12
• （二） 主要試劑和材料12-13
• （三） 主要溶液配制13-16
• （四） 主要儀器16-17
• 二、實驗方法17-22
• （一） 細(xì)胞培養(yǎng)17
• （二） 細(xì)胞傳代、凍存與復(fù)蘇的操作方法17-18
• （三） Transwell 小室遷移實驗18
• （四） 免疫熒光檢測18-19
• （五） Western blot 檢測19-21
• （六） 統(tǒng)計學(xué)處理21-22
• 三、結(jié)果22-31
• （一） rhITF 對 Caco-2 細(xì)胞移行能力的影響22-24
• （二） rhITF 對黏附分子 β-Catenin 和 E-Cadherin 的表達(dá)影響24-27
• （三） rhITF 對磷酸化 β-Catenin 的表達(dá)影響27-31
• 討論31-36
• 1.腸三葉因子對腸上皮細(xì)胞移行能力的影響31
• 2.腸三葉因子對β-Catenin和E-Cadherin的調(diào)控31-33
• 3.腸三葉因子對磷酸化β-Catenin的調(diào)控33-35
• 4.研究展望35-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 致謝41-42
• 附錄 A 主要英文縮寫一覽表42-43
• 附錄 B 主要工作液的配制43-44
• 附錄 C 綜述44-50
• 參考文獻(xiàn)48-50

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：891234