本文關(guān)鍵詞：桔青霉組蛋白去乙�；富騊ci-RpdA和Pci-HdaA的克隆表達(dá)及特征分析

  更多相關(guān)文章： 桔青霉 組蛋白去乙�；� 基因克隆 特征分析 表觀遺傳

【摘要】：背景：絲狀真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物是新藥的重要來(lái)源之一,很多有重要應(yīng)用價(jià)值的抗生素、免疫抑制劑、抗癌藥物等都是由真菌產(chǎn)生。其中,由桔青霉產(chǎn)生的聚酮類化合物美伐他汀是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的他汀類化合物,它是HMG-CoA還原酶的有效的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑,從而抑制膽固醇的生物合成。美伐他汀通常作為微生物轉(zhuǎn)化的底物,進(jìn)一步合成普伐他汀,普伐他汀主要用于治療高膽固醇血癥,具有廣泛的市場(chǎng)前景與消費(fèi)需求。由于他汀類藥物對(duì)人類經(jīng)濟(jì)和健康的巨大影響,桔青霉作為重要藥用微生物資源,其代謝產(chǎn)物及其代謝調(diào)控機(jī)制被廣泛研究。 真菌的次生代謝是一個(gè)復(fù)雜的多層次調(diào)控過(guò)程。次生代謝產(chǎn)物的生物合成不僅受到途徑特異轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,還受到全局性調(diào)控因子的調(diào)控。近年來(lái)對(duì)一些真菌物種進(jìn)行的研究結(jié)果顯示,染色體的表觀遺傳狀態(tài)也直接調(diào)控真菌次生代謝相關(guān)基因簇的表達(dá)。染色體的表觀遺傳狀態(tài)又被稱為染色體異構(gòu)現(xiàn)象,受到“組蛋白密碼”操控,包括組蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等。其中,組蛋白氨基酸末端的乙�；c去乙�；鳛榛蚧罨鸵种七^(guò)程中的主要調(diào)控機(jī)制,成為表觀遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。乙�；腿ヒ阴；謩e由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙�；高M(jìn)行可逆修飾,兩類酶是組蛋白乙酰化和轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)者。組蛋白去乙酰化酶能夠?qū)⑷旧w上的乙�；稽c(diǎn)去除,從而改變?nèi)旧w的表觀遺傳狀態(tài),調(diào)控次生代謝產(chǎn)物基因簇的表達(dá)。近年以組蛋白去乙�；笧榘悬c(diǎn)的微生物育種和微生物沉默基因挖掘引起了科學(xué)家的關(guān)注：通過(guò)使用小分子表觀遺傳抑制劑對(duì)真菌中組蛋白去乙�；富钚赃M(jìn)行抑制,或者在基因水平上對(duì)真菌組蛋白去乙酰化酶編碼基因進(jìn)行分子操作(如基因敲除),真菌的次生代謝行為發(fā)生明顯變化,多種已知次生代謝產(chǎn)物表達(dá)得以提高,甚至激活了基因組中的沉默基因,使真菌產(chǎn)生了新的化合物,為發(fā)現(xiàn)新的具有藥學(xué)研究?jī)r(jià)值的先導(dǎo)化合物提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 目的：本實(shí)驗(yàn)選取桔青霉野生菌株ATCC38065,從ATCC38065中克隆得到兩個(gè)分屬不同分類家族的組蛋白去乙�；妇幋a基因Pci-RpdA和Pci-HdaA,并對(duì)其進(jìn)行了體外表達(dá)的初探和生物信息學(xué)解析,為從表觀遺傳調(diào)控的角度對(duì)桔青霉進(jìn)行分子操作提供候選基因和作用靶點(diǎn),以期提高其主要代謝產(chǎn)物產(chǎn)量或激活沉默基因；檢測(cè)Pci-RpdA和Pci-HdaA兩個(gè)基因在不同發(fā)酵時(shí)期的相對(duì)表達(dá)情況,從而揭示兩基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征,為研究其功能奠定基礎(chǔ)；比較組蛋白去乙�；妇幋a基因在美伐他汀高產(chǎn)工業(yè)菌株IMB002中的序列差異,推斷由序列差異所引起的酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。 方法：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)多個(gè)真菌物種的組蛋白去乙酰化酶編碼基因序列進(jìn)行比較分析,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,以桔青霉cDNA和DNA為模板,結(jié)合3'-race技術(shù)及套式PCR方法,克隆獲取Pci-RpdA和Pci-HdaA的全長(zhǎng)DNA序列和全長(zhǎng)cDNA序列,使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)編碼基因進(jìn)行體外表達(dá),并通過(guò)在線分析工具及生物軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Pci-RpdA和Pci-HdaA兩基因在桔青霉野生菌株ATCC38065發(fā)酵過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征；克隆工業(yè)菌株IMB002中Pci-RpdA和Pci-HdaA兩基因DNA和cDNA全長(zhǎng)序列,使用序列分析軟件對(duì)兩基因的核酸序列和蛋白產(chǎn)物進(jìn)行序列對(duì)比與差異分析。 結(jié)果：本文成功從桔青霉野生菌株ATCC38065中克隆得到與Rpd3同源基因Pci-RpdA和與Hdal的同源基因Pci-HdaA。Pci-RpdA基因長(zhǎng)2072bp,含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,cDNA開放閱讀框長(zhǎng)為1092bp,理論分子量為71.12kDa,預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為4.61,編碼639個(gè)氨基酸,與產(chǎn)黃青霉中Rpd3在蛋白水平的一致性達(dá)95%,蛋白結(jié)構(gòu)顯示了較為保守的組蛋白去乙酰化酶ClassⅠ家族結(jié)構(gòu)特征；Pci-HdaA基因長(zhǎng)3053bp,含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子,cDNA開放閱讀框長(zhǎng)為2295bp,理論分子量為84.80kDa,預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為5.38,編碼764個(gè)氨基酸,與產(chǎn)黃青霉中Hdal在蛋白水平的一致性達(dá)89%,蛋白結(jié)構(gòu)顯示了較為保守的組蛋白去乙�；窩lassⅡ家族結(jié)構(gòu)特征。 成功構(gòu)建基于pET-28(+)的Pci-RpdA和Pci-HdaA基因的體外重組表達(dá)載體pET-28(+)-RpdA和pET-28(+)-HdaA。初步探討了重組RpdA和重組HdaA在大腸桿菌中的表達(dá)形式,并成功純化出重組RpdA蛋白。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,在桔青霉野生菌株發(fā)酵的不同階段,Pci-RpdA基因的轉(zhuǎn)錄水平具有顯著性差異,特別是在發(fā)酵前期轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較高,而在發(fā)酵中后期轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)下調(diào)；基因Pci-HdaA在不同的發(fā)酵階段轉(zhuǎn)錄水平也具有顯著性差異,在發(fā)酵中后期基因處于相對(duì)較高轉(zhuǎn)錄水平,而在發(fā)酵前期基因的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較低。 兩基因在野生菌株ATCC38065和工業(yè)菌株IMB002中序列差異分析顯示,由于Pci-RpdA基因序列在第170位和1786位核酸序列的突變,使得桔青霉野生菌株ATCC38065中第57位精氨酸和第596位脯氨酸,在桔青霉工業(yè)菌株IMB002中分別突變成了賴氨酸和絲氨酸。將兩株菌中的Pci-RpdA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)由于57位氨基酸的突變,在野生菌株ATCC38065中Pci-RpdA蛋白的第59-60位氨基酸殘基所形成的卷曲結(jié)構(gòu),在IMB002菌株中形成了一個(gè)小的B-折疊結(jié)構(gòu)；596位氨基酸的突變,對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有造成影響。由于基因序列在第718位和1141位核酸序列的突變,使得桔青霉野生菌株ATCC38065中第240位纈氨酸殘基和第381位丙氨酸殘基,在工業(yè)型菌株IMB002分別突變成了異亮氨酸和蘇氨酸。240位氨基酸的突變,對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有造成影響。由于381位氨基酸的突變,在野生菌種ATCC38065中Pci-HdaA蛋白的第366-380位氨基酸殘基所形成的α-螺旋結(jié)構(gòu),在IMB002菌株中縮短至366-377位。 結(jié)論：克隆了桔青霉的組蛋白去乙�；富騊ci-RpdA和Pci-HdaA,為后續(xù)對(duì)桔青霉進(jìn)行表觀遺傳育種奠定基礎(chǔ)。得到了在大腸桿菌中重組表達(dá)的RpdA蛋白,為后續(xù)酶活表征該蛋白提供物質(zhì)基礎(chǔ)。詳細(xì)了解了Pci-RpaA和與Pci-HdaA及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)了Pci-RpdA在發(fā)酵前期相對(duì)高表達(dá)、Pci-HdaA在發(fā)酵中后期相對(duì)高表達(dá)的重要特征,為進(jìn)一步研究?jī)苫虻墓δ芴峁├碚撘罁?jù)。比較了兩基因在野生菌株和工業(yè)菌株中的序列差異,為探討組蛋白去乙酰化酶與菌株高產(chǎn)代謝產(chǎn)物的相關(guān)性提供研究線索,也為揭示真核生物中復(fù)雜的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供研究素材。
【關(guān)鍵詞】：桔青霉 組蛋白去乙酰化酶 基因克隆 特征分析 表觀遺傳
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• LIST OF ABBREVIATIONS12-13
• 第1章 綜述13-21
• 1.1 組蛋白乙�；谋碛^遺傳基礎(chǔ)13-15
• 1.1.1 染色體結(jié)構(gòu)、組蛋白修飾與基因表達(dá)調(diào)控13-14
• 1.1.2 組蛋白乙�；稽c(diǎn)14-15
• 1.2 組蛋白去乙酰化酶研究現(xiàn)狀15-18
• 1.2.1 組蛋白去乙�；傅姆诸�15-16
• 1.2.2 組蛋白乙�；c人類健康16-17
• 1.2.3 組蛋白去乙�；富蛟谡婢蛘{(diào)控和發(fā)育中的作用17-18
• 1.3 表觀遺傳修飾與新藥發(fā)現(xiàn)18-21
• 1.3.1 沉默基因與表觀遺傳修飾18-19
• 1.3.2 表觀遺傳育種-開發(fā)微生物藥物新手段19-21
• 第2章 緒論21-23
• 2.1 本實(shí)驗(yàn)課題的提出21
• 2.2 本研究的內(nèi)容目的及意義21-23
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)主要研究?jī)?nèi)容21-22
• 2.2.2 研究目的及意義22-23
• 第3章 實(shí)驗(yàn)材料與方法23-31
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料23-26
• 3.1.1 菌株與載體23
• 3.1.2 試劑與培養(yǎng)基23-24
• 3.1.3 引物、酶與試劑盒24-25
• 3.1.4 主要使用儀器25-26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法26-31
• 3.2.1 基因組DNA和總RNA的提取26
• 3.2.2 紫外分光光度法檢查總RNA含量26
• 3.2.3 RT-PCR26-27
• 3.2.4 擴(kuò)增Pci-RpdA和Pci-HdaA基因核心片段27-28
• 3.2.5 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因3’端快速擴(kuò)增(RACE技術(shù))28
• 3.2.6 擴(kuò)增Pci-HdaA基因5’端序列(套式PCR)28-29
• 3.2.7 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因全長(zhǎng)克隆29
• 3.2.8 測(cè)序29
• 3.2.9 生物信息學(xué)分析29
• 3.2.10 Pci-RpdA和Pci-HdaA的重組載體構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)29-30
• 3.2.11 qRT-PCR檢測(cè)Pci-RpdA和Pci-HdaA基因表達(dá)量30
• 3.2.12 工業(yè)菌株IMB002中Pci-RpdA和Pci-HdaA基因全長(zhǎng)克隆30
• 3.2.13 序列對(duì)比30-31
• 第4章 結(jié)果與分析31-55
• 4.1 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因的克隆31-37
• 4.1.1 總基因組提取31
• 4.1.2 總RNA提取31-32
• 4.1.3 Pci-RpdA和Pci-HdaA核心片段的克隆32-33
• 4.1.4 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因3’端cDNA序列克隆33-34
• 4.1.5 Pci-HdaA基因5’端片段擴(kuò)增34-35
• 4.1.6 Pci-RpdA和Pci-HdaA基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增及基因結(jié)構(gòu)分析35-37
• 4.2 Pci-RpdA和Pci-HdaA的生物信息學(xué)解析37-43
• 4.2.1 Pci-RpdA和Pci-HdaA氨基酸序列分析37-40
• 4.2.2 Pci-RpdA和Pci-HdaA蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析40-42
• 4.2.3 Pci-RpdA和Pci-HdaA的同源性及進(jìn)化樹分析42-43
• 4.3 Pci-RpdA和Pci-HdaA的重組表達(dá)與純化43-47
• 4.3.1 pET28a(+)-RpdA和pET28a(+)-HdaA載體構(gòu)建與驗(yàn)證43-44
• 4.3.2 重組RpdA和重組HdaA的誘導(dǎo)表達(dá)初探44-45
• 4.3.3 重組RpdA的分離純化45-47
• 4.4 Pci-RpdA和Pci-HdaA在桔青霉發(fā)酵過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄特征分析47-50
• 4.4.1 桔青霉生長(zhǎng)曲線的繪制47-48
• 4.4.2 Pci-RpdA和Pci-HdaA在菌株發(fā)酵過(guò)程中的qRT-PCR檢測(cè)及分析48-50
• 4.5 工業(yè)菌株中Pci-RpdA和Pci-HdaA克隆及序列差異分析50-55
• 4.5.1 工業(yè)菌株中Pci-RpdA克隆及序列差異分析50-52
• 4.5.2 工業(yè)菌株中Pci-HdaA克隆及序列差異分析52-55
• 第5章 討論55-61
• 5.1 Pci-RpdA的特征討論55-56
• 5.2 Pci-HdaA的特征討論56
• 5.3 高產(chǎn)菌株序列差異的相關(guān)性討論56-58
• 5.4 總結(jié)與創(chuàng)新點(diǎn)58-59
• 5.5 展望59-61
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 在讀期間發(fā)表論文及所獲獎(jiǎng)勵(lì)65-67
• 致謝67-68

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：889246