發(fā)布時間：2017-09-20 11:33

  本文關鍵詞：腸道病毒71型全基因組序列分析及VP1基因毒力位點研究

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【摘要】：腸道病毒71型(enterovirus71, EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員,是引起手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)的主要病原體之一。此外,EV71還可侵犯呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)而引起腦炎、心肌炎、肺水腫和弛緩性麻痹等癥狀。近年來亞洲地區(qū)的EV71流行呈上升趨勢。 目的 1.擴增EV71毒株基因組全序列,篩選神經(jīng)毒力位點； 2.構建VP1蛋白的表達載體及突變體,從VP1基因上尋找可疑毒力位點,比較突變前后其引起的細胞損傷的變化情況。 方法 1.設計9對首尾相接的引物擴增3株SC-EV71(SDLY96、SDLY107、 SDLY153)基因組全序列,將此3株毒株的基因組全序列與本實驗室擴增的3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)及GenBank中的25株臨床類型明確的EV71毒株的基因組全序列進行序列比對。 2.設計引物擴增23株EV71毒株的VP1基因并測序,以BioEdit7.09和Mega4.0軟件對測序結果進行分析。 3.設計引物擴增SDLY11及SDLY107株的VP1基因,構建表達載體pcDNA3.1(+)/11VP1及pcDNA3.1(+)/107VP1。將3株SC-EV71(SDLY96、 SDLY107、SDLY153)和3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)的VP1序列進行比對,篩選出3個可疑氨基酸位點P98、P145及P289,設計突變引物,以pcDNA3.1(+)/107VP1為模板,同源重組PCR法構建3個單個氨基酸突變的表達載體107VP1/K98E、107VP1/E145G、107VP1/A289T。上述5個表達載體轉染RD細胞后,Giemsa染色、間接免疫熒光、(?)(?)estern blot進行細胞病變程度的定性檢測,乳酸脫氫酶法(LDH)細胞毒性檢測法進行細胞病變程度的定量檢測。 4.從已測知全序列的6株毒株中,選取分離自死亡病例的SDLY107株,采用多種方法構建全長cDNA質粒,構建失敗后合成全長cDNA質粒pCDNA3.1(+)/SDLY107,(?)各全長cDNA質粒酶切線性化,進行體外轉錄制備RNA轉錄本,RNA轉錄本轉染RD細胞。 結果 1.擴增出SDLY96、SDLY107及SDLY153株的基因組全序列,將此3株毒株的基因組全序列與本實驗室擴增的3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)及GenBank中的25株臨床類型明確的EV71毒株的基因組全序列進行序列比對,共篩選出3個有意義的位點,這三個位點分別為ValP814/IleP814、Valp1148/IleP1148和Ala P1728/CysP1728/Va1P1728 2.擴增出23株毒株的VP1基因。將此23株毒株的VPl序列與各基因型代表株的VP1序列進行比對,發(fā)現(xiàn)此23株EV71分離株與A、B基因型同源性較低；與C4亞型的C4a群代表株的核苷酸和氨基酸同源性分別為92.8%-93.5%和98.3%～99.3%,明顯高于其他亞型代表株的同源性。 3.構建了表達載體pcDNA3.1(+)/11P1、pcDNA3.1(+)/107VP1及突變體107VP1/K98E、107VP1/E145G、107VP1/A289T。Giemsa染色顯示轉染了5種表達載體的細胞均有不同程度的細胞損傷；間接免疫熒光顯示轉染了5種表達載體的細胞均有亮綠色熒光信號產(chǎn)生；Western blot(?)顯示轉染了5種表達載體的細胞均可表達34KD的VP1蛋白,LDH法細胞毒性檢測結果顯示pcDNA3.1(+)/107VP1、107VP1/k98E、107VP1/A289T引起的細胞損傷程度最大且基本相同,pcDNA3.1(+)/11VP1引起的細胞損傷程度最小,107VP1/E145G引起的細胞損傷程度介于中間。 4.由于構建SDLY107全長cDNA質粒失敗,將其序列送公司合成全長cDNA質粒pCDNA3.1(+)-SDLY107,將其酶切線性化,制備RNA轉錄本轉染RD細胞。目前尚未觀察到細胞病變,細胞培養(yǎng)物提取RNA后PCR鑒定也未獲得相應片段。 結論 1.全基因組序列比對篩選出3個可能與神經(jīng)毒力相關或與基因型相關的位點,分別為位于VPl的ValP814/IleP814、位于3A的Valp1148/IleP1148和位于3C的Ala P1728/Cys P1728/Val P1728。 2.23株毒株的VPl序列與各基因型代表株的VP1序列進行比對,發(fā)現(xiàn)此23株EV71分離株屬C4亞型的C4a群。 3.VP1蛋白的第145位氨基酸(基因組全序列第710位氨基酸)是可疑毒力位點,E→G突變后其引起的細胞損傷程度降低。
【關鍵詞】：腸道病毒71型 毒力位點 VP1基因
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373.25;R3416
【目錄】：

• 目錄4-5
• CATALOGUE5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-47
• 一、材料17-28
• 二、方法28-47
• 結果47-69
• 一、病毒的分離鑒定47-48
• 二、基因組全序列擴增及分析48-54
• 三、VP1基因擴增及序列分析54-59
• 四、單氨基酸位點突變對VP1蛋白引起的細胞損傷的影響59-67
• 五、全長感染性CDNA克隆的構建67-69
• 討論69-74
• 一、病毒的分離鑒定69
• 二、EV71基因組全序列的分析69-71
• 三、VP1基因擴增及序列分析71
• 四、單氨基酸位點突變對VP1蛋白引起的細胞損傷的影響71-72
• 五、EV71全長感染性CDNA克隆的構建72-74
• 結論74-75
• 創(chuàng)新之處75-76
• 附錄、附圖76-84
• 參考文獻84-90
• 致謝90-91
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文91-92
• 學位論文評閱及答辯情況表92

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 董曉楠;應劍;陳應華;;1970～2004年全球腸道病毒71型分離株的分子流行病學分析[J];科學通報;2007年09期

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本文編號：887803