發(fā)布時(shí)間：2017-09-20 11:33

  本文關(guān)鍵詞：腸道病毒71型全基因組序列分析及VP1基因毒力位點(diǎn)研究

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【摘要】：腸道病毒71型(enterovirus71, EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員,是引起手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)的主要病原體之一。此外,EV71還可侵犯呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)而引起腦炎、心肌炎、肺水腫和弛緩性麻痹等癥狀。近年來亞洲地區(qū)的EV71流行呈上升趨勢(shì)。 目的 1.擴(kuò)增EV71毒株基因組全序列,篩選神經(jīng)毒力位點(diǎn)； 2.構(gòu)建VP1蛋白的表達(dá)載體及突變體,從VP1基因上尋找可疑毒力位點(diǎn),比較突變前后其引起的細(xì)胞損傷的變化情況。 方法 1.設(shè)計(jì)9對(duì)首尾相接的引物擴(kuò)增3株SC-EV71(SDLY96、SDLY107、 SDLY153)基因組全序列,將此3株毒株的基因組全序列與本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增的3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)及GenBank中的25株臨床類型明確的EV71毒株的基因組全序列進(jìn)行序列比對(duì)。 2.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增23株EV71毒株的VP1基因并測(cè)序,以BioEdit7.09和Mega4.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。 3.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SDLY11及SDLY107株的VP1基因,構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/11VP1及pcDNA3.1(+)/107VP1。將3株SC-EV71(SDLY96、 SDLY107、SDLY153)和3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)的VP1序列進(jìn)行比對(duì),篩選出3個(gè)可疑氨基酸位點(diǎn)P98、P145及P289,設(shè)計(jì)突變引物,以pcDNA3.1(+)/107VP1為模板,同源重組PCR法構(gòu)建3個(gè)單個(gè)氨基酸突變的表達(dá)載體107VP1/K98E、107VP1/E145G、107VP1/A289T。上述5個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后,Giemsa染色、間接免疫熒光、(?)(?)estern blot進(jìn)行細(xì)胞病變程度的定性檢測(cè),乳酸脫氫酶法(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)法進(jìn)行細(xì)胞病變程度的定量檢測(cè)。 4.從已測(cè)知全序列的6株毒株中,選取分離自死亡病例的SDLY107株,采用多種方法構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒,構(gòu)建失敗后合成全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/SDLY107,(?)各全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒酶切線性化,進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄制備RNA轉(zhuǎn)錄本,RNA轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞。 結(jié)果 1.擴(kuò)增出SDLY96、SDLY107及SDLY153株的基因組全序列,將此3株毒株的基因組全序列與本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增的3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)及GenBank中的25株臨床類型明確的EV71毒株的基因組全序列進(jìn)行序列比對(duì),共篩選出3個(gè)有意義的位點(diǎn),這三個(gè)位點(diǎn)分別為ValP814/IleP814、Valp1148/IleP1148和Ala P1728/CysP1728/Va1P1728 2.擴(kuò)增出23株毒株的VP1基因。將此23株毒株的VPl序列與各基因型代表株的VP1序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)此23株EV71分離株與A、B基因型同源性較低；與C4亞型的C4a群代表株的核苷酸和氨基酸同源性分別為92.8%-93.5%和98.3%～99.3%,明顯高于其他亞型代表株的同源性。 3.構(gòu)建了表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/11P1、pcDNA3.1(+)/107VP1及突變體107VP1/K98E、107VP1/E145G、107VP1/A289T。Giemsa染色顯示轉(zhuǎn)染了5種表達(dá)載體的細(xì)胞均有不同程度的細(xì)胞損傷；間接免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染了5種表達(dá)載體的細(xì)胞均有亮綠色熒光信號(hào)產(chǎn)生；Western blot(?)顯示轉(zhuǎn)染了5種表達(dá)載體的細(xì)胞均可表達(dá)34KD的VP1蛋白,LDH法細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示pcDNA3.1(+)/107VP1、107VP1/k98E、107VP1/A289T引起的細(xì)胞損傷程度最大且基本相同,pcDNA3.1(+)/11VP1引起的細(xì)胞損傷程度最小,107VP1/E145G引起的細(xì)胞損傷程度介于中間。 4.由于構(gòu)建SDLY107全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒失敗,將其序列送公司合成全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-SDLY107,將其酶切線性化,制備RNA轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞。目前尚未觀察到細(xì)胞病變,細(xì)胞培養(yǎng)物提取RNA后PCR鑒定也未獲得相應(yīng)片段。 結(jié)論 1.全基因組序列比對(duì)篩選出3個(gè)可能與神經(jīng)毒力相關(guān)或與基因型相關(guān)的位點(diǎn),分別為位于VPl的ValP814/IleP814、位于3A的Valp1148/IleP1148和位于3C的Ala P1728/Cys P1728/Val P1728。 2.23株毒株的VPl序列與各基因型代表株的VP1序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)此23株EV71分離株屬C4亞型的C4a群。 3.VP1蛋白的第145位氨基酸(基因組全序列第710位氨基酸)是可疑毒力位點(diǎn),E→G突變后其引起的細(xì)胞損傷程度降低。
【關(guān)鍵詞】：腸道病毒71型 毒力位點(diǎn) VP1基因
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.25;R3416
【目錄】：

• 目錄4-5
• CATALOGUE5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-17
• 材料與方法17-47
• 一、材料17-28
• 二、方法28-47
• 結(jié)果47-69
• 一、病毒的分離鑒定47-48
• 二、基因組全序列擴(kuò)增及分析48-54
• 三、VP1基因擴(kuò)增及序列分析54-59
• 四、單氨基酸位點(diǎn)突變對(duì)VP1蛋白引起的細(xì)胞損傷的影響59-67
• 五、全長(zhǎng)感染性CDNA克隆的構(gòu)建67-69
• 討論69-74
• 一、病毒的分離鑒定69
• 二、EV71基因組全序列的分析69-71
• 三、VP1基因擴(kuò)增及序列分析71
• 四、單氨基酸位點(diǎn)突變對(duì)VP1蛋白引起的細(xì)胞損傷的影響71-72
• 五、EV71全長(zhǎng)感染性CDNA克隆的構(gòu)建72-74
• 結(jié)論74-75
• 創(chuàng)新之處75-76
• 附錄、附圖76-84
• 參考文獻(xiàn)84-90
• 致謝90-91
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文91-92
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表92

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 董曉楠;應(yīng)劍;陳應(yīng)華;;1970～2004年全球腸道病毒71型分離株的分子流行病學(xué)分析[J];科學(xué)通報(bào);2007年09期

2 檀曉娟;許文波;;腸道病毒71型的分子流行病學(xué)現(xiàn)況[J];中國疫苗和免疫;2008年04期

3 呂作芝;薄志堅(jiān);;腸道病毒71型流行病學(xué)與病原學(xué)研究進(jìn)展[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2009年09期

4 邱曉楓;祝水芬;濮小英;葉榕;張國忠;李鈞;繆凡;黃志成;;杭州市腸道病毒71型的分離與VP1區(qū)域序列分析[J];中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2011年12期

5 林思恩,章青,謝華萍,謝健萍,何家鑫,董巧麗,方肇寅;我國廣東、福建地區(qū)2000～2001年手足口病腸道病毒71型分離株的種系進(jìn)化分析[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2004年03期

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本文編號(hào)：887803