本文關(guān)鍵詞：重組慢病毒pWPXLd-Raf載體的構(gòu)建及鑒定

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【摘要】：研究背景及意義 胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，在西方國家其死亡率排在惡性腫瘤類別的第4位。我國胰腺癌發(fā)病率逐年上升，近20年增長迅速。同時(shí)，胰腺癌的發(fā)病率與死亡率很接近，五年內(nèi)生存率極低，在所有癌癥生存率排行榜中排行最低。因此為了提高胰腺癌患者總的生存率，需要研究有效的新的治療方法。其關(guān)鍵則在于加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，對(duì)其發(fā)病機(jī)理和分子生物學(xué)特性的進(jìn)一步闡明，可有助于我們提高對(duì)胰腺癌的治療水平。 Ras基因首先在鼠肉瘤病毒的子代病毒中發(fā)現(xiàn)，，在正常人細(xì)胞中有表達(dá)，目前人類細(xì)胞中有三種Ras存在：H-ras、K-ras及N-ras等類似的基因。Ras激活后介導(dǎo)細(xì)胞生長與分裂信號(hào)，點(diǎn)突變、基因插入及過度表達(dá)均可導(dǎo)致Ras激活�；罨腞as翻譯成異常的Ras蛋白參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展中。在90%左右的胰腺癌中存在K-ras突變，提示Ras在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但是目前Ras信號(hào)通路在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用還不清楚。 Ras-Raf-Erk是Ras的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，由Ras連接的受體酪氨酸激酶（RTK）及胞漿激酶所構(gòu)成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Ras具有內(nèi)源性GTP酶的活性，其活化后可催化GTP水解成GDP，傳遞上游信號(hào)。突變的Ras基因所編碼的蛋白會(huì)引起下游通路持續(xù)激活，激活包括Ras-Raf-Erk在內(nèi)的若干條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中Raf是MAPK激酶激酶，其作用是磷酸化并激活下游底物MAPK激酶，其具有活化酪氨酸/蘇氨酸殘基的功能。Raf包括有A-Raf、B-Raf、C-Raf三種亞型，其中B-Raf是此通路中產(chǎn)生活性最強(qiáng)的激酶，在人類腫瘤細(xì)胞中有30多個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)存在，是最有潛能的治療靶點(diǎn)。 研究目的 本研究通過制作能特異性表達(dá)B-Raf蛋白激酶的慢病毒載體，用此病毒感染原代胰腺腺泡細(xì)胞，并驗(yàn)證慢病毒載體的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)的下一步可用原代細(xì)胞注射于裸鼠胰腺體內(nèi)，模擬制作胰腺癌動(dòng)物模型。 研究方法 1.制作pWPXLd-Raf慢病毒載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)菌中。 2.大量擴(kuò)增和提取重組質(zhì)粒。 3.包裝慢病毒并濃縮病毒上清。 4.培養(yǎng)293T細(xì)胞及原代胰腺腺泡細(xì)胞。 5.構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，慢病毒感染胰腺腺泡細(xì)胞。 6.用蛋白印跡法驗(yàn)證磷酸化Erk蛋白激酶在兩種細(xì)胞中的表達(dá)水平。 結(jié)果 酶切電泳法證明目的基因已插入構(gòu)建慢病毒載體，濃縮慢病毒感染293T細(xì)胞及原代胰腺上皮細(xì)胞后，用蛋白印跡法方法證明其下游信號(hào)磷酸化Erk在兩種細(xì)胞中的表達(dá)水平增高，重組載體能表達(dá)B-Raf蛋白激酶活性，構(gòu)建成功。研究的下一步將已感染病毒的原代細(xì)胞原位注射于裸鼠胰腺上模擬腫瘤模型。 結(jié)論 重組慢病毒載體pWPXLd-Raf能特異性表達(dá)B-Raf蛋白激酶活性，構(gòu)建成功。
【關(guān)鍵詞】：胰腺癌 Ras-Raf-Erk B-Raf 慢病毒 腺泡細(xì)胞 動(dòng)物模型
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R346
【目錄】：

• 主要縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 材料和方法14-27
• 結(jié)果27-32
• 附圖32-33
• 討論33-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-44
• 綜述44-54
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 致謝54

【參考文獻(xiàn)】

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1 馮小明;張杰;劉永生;陳豪泰;馬麗娜;孫德惠;;慢病毒載體及慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2009年03期

本文編號(hào)：884241