發(fā)布時(shí)間：2017-09-19 17:30

  本文關(guān)鍵詞：pIRES-Ag85A-ESAT6抗結(jié)核二價(jià)DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效應(yīng)研究

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【摘要】：目的 通過(guò)以pIRES質(zhì)粒為載體構(gòu)建可同時(shí)獨(dú)立表達(dá)Ag85A和ESAT6兩種抗原的抗結(jié)核二價(jià)DNA疫苗,并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫原性及免疫效應(yīng),為新型結(jié)核疫苗的研發(fā)提供新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 1.根據(jù)GenBank報(bào)道的目的基因(Ag85A和ESAT6基因)全長(zhǎng)序列和pIRES質(zhì)粒酶切位點(diǎn)的特點(diǎn),利用DNAClub及Premier Primer5軟件設(shè)計(jì)特異性引物。以結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA為模版,經(jīng)PCR擴(kuò)增Ag85A和ESAT6基因,分別用限制性?xún)?nèi)切酶Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ、Eag Ⅰ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和pIRES空質(zhì)粒雙酶切,經(jīng)連接酶連接,構(gòu)建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒,并經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切和質(zhì)粒測(cè)序鑒定。 2. pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒鑒定構(gòu)建成功后,轉(zhuǎn)入DH5a菌株,篩選重組質(zhì)粒,并用質(zhì)粒小提試劑盒分離純化質(zhì)粒DNA。 3.將重組質(zhì)粒采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞,于5%CO2培養(yǎng)箱中,37℃,培養(yǎng)24-48h后,western blot法檢測(cè)質(zhì)粒蛋白表達(dá)情況。 4.大量提取重組質(zhì)粒,經(jīng)三次肌肉注射質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠,每次間隔2w,末次免疫2w后,取小鼠血清,用ELISA法檢測(cè)血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體情況。 5.同時(shí)無(wú)菌取小鼠脾細(xì)胞在Ag85A和ESAT6蛋白刺激下培養(yǎng),用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4)分泌情況。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR鑒定、質(zhì)粒雙酶切,DNA凝膠電泳后,分別出現(xiàn)1017bp和288bp的條帶,與Ag85A和ESAT6的理論值相符,并經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步鑒定構(gòu)建成功。 2.分別將用三種濃度的pIRES-Ag85A-ESAT6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞后,經(jīng)western blot鑒定證實(shí)了Ag85A和ESAT6兩種蛋白可在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá),且表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染劑量存在正相關(guān)。 3. ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體變化情況,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了pIRES-Ag85A-ESAT6質(zhì)粒的二價(jià)疫苗組,相應(yīng)的抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體明顯升高,(P0.05),且IgG2a抗體升高明顯。 4.在細(xì)胞因子檢測(cè)中,pIRES-Ag85A-ESAT6質(zhì)粒組的IFN-γ、IL-2水平顯著升高(P0.05),而IL-4的值均較低,組間無(wú)顯著差異性。 結(jié)論 1. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗,能夠在真核細(xì)胞中獨(dú)立表達(dá)Ag85A和ESAT6兩種抗原。 2. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗可誘導(dǎo)小鼠強(qiáng)烈的特異性免疫應(yīng)答,且以Th1優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答為主。 3. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗較單一Ag85A或ESAT6疫苗特異性免疫應(yīng)答強(qiáng)。
【關(guān)鍵詞】：二價(jià)疫苗 Ag85A ESAT6 結(jié)核 免疫效應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 插圖或附表清單11-12
• 注釋說(shuō)明清單12-14
• 引言14-17
• 第一部分 獨(dú)立表達(dá)Ag85A與ESAT6的抗結(jié)核二價(jià)DNA疫苗的構(gòu)建17-35
• 1.1 材料17-20
• 1.2 方法20-28
• 1.3 結(jié)果28-33
• 1.4 討論33-35
• 第二部分 Ag85A和ESAT6抗結(jié)核二價(jià)DNA疫苗免疫效應(yīng)研究35-46
• 2.1 材料35-37
• 2.2 方法37-41
• 2.3 結(jié)果41-44
• 2.4 討論44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 附錄A pIRES質(zhì)粒圖譜52-53
• 附錄B 重組質(zhì)粒pIRES-Ag85A-ESAT6測(cè)序圖53-55
• 致謝55-56
• 作者簡(jiǎn)介及讀研期間主要科研成果56
• 在讀期間參與撰寫(xiě)的文章56

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：882988