本文關鍵詞：pIRES-Ag85A-ESAT6抗結核二價DNA疫苗的構建及其免疫效應研究

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【摘要】：目的 通過以pIRES質粒為載體構建可同時獨立表達Ag85A和ESAT6兩種抗原的抗結核二價DNA疫苗,并經(jīng)體外實驗評價其免疫原性及免疫效應,為新型結核疫苗的研發(fā)提供新的思路和實驗基礎。 方法 1.根據(jù)GenBank報道的目的基因(Ag85A和ESAT6基因)全長序列和pIRES質粒酶切位點的特點,利用DNAClub及Premier Primer5軟件設計特異性引物。以結核桿菌標準株H37Rv的DNA為模版,經(jīng)PCR擴增Ag85A和ESAT6基因,分別用限制性內切酶Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ、Eag Ⅰ對擴增產(chǎn)物和pIRES空質粒雙酶切,經(jīng)連接酶連接,構建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質粒,并經(jīng)菌液PCR、質粒雙酶切和質粒測序鑒定。 2. pIRES-Ag85A-ESAT6重組質粒鑒定構建成功后,轉入DH5a菌株,篩選重組質粒,并用質粒小提試劑盒分離純化質粒DNA。 3.將重組質粒采用脂質體法轉染至RAW264.7細胞,于5%CO2培養(yǎng)箱中,37℃,培養(yǎng)24-48h后,western blot法檢測質粒蛋白表達情況。 4.大量提取重組質粒,經(jīng)三次肌肉注射質粒免疫BALB/c小鼠,每次間隔2w,末次免疫2w后,取小鼠血清,用ELISA法檢測血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體情況。 5.同時無菌取小鼠脾細胞在Ag85A和ESAT6蛋白刺激下培養(yǎng),用ELISA法檢測培養(yǎng)液中細胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4)分泌情況。 結果 1.成功構建pIRES-Ag85A-ESAT6重組質粒,經(jīng)PCR鑒定、質粒雙酶切,DNA凝膠電泳后,分別出現(xiàn)1017bp和288bp的條帶,與Ag85A和ESAT6的理論值相符,并經(jīng)測序進一步鑒定構建成功。 2.分別將用三種濃度的pIRES-Ag85A-ESAT6重組質粒轉染至RAW264.7細胞后,經(jīng)western blot鑒定證實了Ag85A和ESAT6兩種蛋白可在細胞內成功表達,且表達水平與轉染劑量存在正相關。 3. ELISA法檢測免疫小鼠血清中抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體變化情況,發(fā)現(xiàn)轉染了pIRES-Ag85A-ESAT6質粒的二價疫苗組,相應的抗Ag85A抗體和抗ESAT6抗體明顯升高,(P0.05),且IgG2a抗體升高明顯。 4.在細胞因子檢測中,pIRES-Ag85A-ESAT6質粒組的IFN-γ、IL-2水平顯著升高(P0.05),而IL-4的值均較低,組間無顯著差異性。 結論 1. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗,能夠在真核細胞中獨立表達Ag85A和ESAT6兩種抗原。 2. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗可誘導小鼠強烈的特異性免疫應答,且以Th1優(yōu)勢免疫應答為主。 3. pIRES-Ag85A-ESAT6DNA疫苗較單一Ag85A或ESAT6疫苗特異性免疫應答強。
【關鍵詞】：二價疫苗 Ag85A ESAT6 結核 免疫效應
【學位授予單位】：安徽理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 插圖或附表清單11-12
• 注釋說明清單12-14
• 引言14-17
• 第一部分 獨立表達Ag85A與ESAT6的抗結核二價DNA疫苗的構建17-35
• 1.1 材料17-20
• 1.2 方法20-28
• 1.3 結果28-33
• 1.4 討論33-35
• 第二部分 Ag85A和ESAT6抗結核二價DNA疫苗免疫效應研究35-46
• 2.1 材料35-37
• 2.2 方法37-41
• 2.3 結果41-44
• 2.4 討論44-46
• 結論46-47
• 參考文獻47-52
• 附錄A pIRES質粒圖譜52-53
• 附錄B 重組質粒pIRES-Ag85A-ESAT6測序圖53-55
• 致謝55-56
• 作者簡介及讀研期間主要科研成果56
• 在讀期間參與撰寫的文章56

【參考文獻】

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本文編號：882988