本文關(guān)鍵詞：拮抗抗病毒因子A3G的HIV-1 Vif E3復(fù)合體對RBX的選擇性研究

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【摘要】：HIV-1Vif是分子大小為23KD病毒輔助蛋白，它對于在細胞內(nèi)以特定方式產(chǎn)生有感染性的病毒是十分必要的。vif缺失使得病毒在感染非允許細胞時其復(fù)制受到了嚴重抑制。研究發(fā)現(xiàn)將允許細胞與非允許細胞融合的異核體顯示了非允許細胞的特性，說明在非允許細胞內(nèi)存在某種抑制因子，在后續(xù)研究中證實這種限制因子為CEM15，現(xiàn)在普遍稱為A3G。A3G是廣泛存在于非允許細胞內(nèi)的一類胞苷脫氨酶，這種活性在病毒基因逆轉(zhuǎn)錄時會使病毒負義鏈DNA上出現(xiàn)C到U的基因組高突變，同時A3G也可以阻止病毒逆轉(zhuǎn)錄和DNA的整合。 在非允許細胞內(nèi)Vif可以拮抗A3G的抗病毒作用，其機制主要是通過形成以Vif作為接頭蛋白包括CBFβ，Cullin5，ElonginC、ElonginB、RBX蛋白在內(nèi)的六連體E3連接酶復(fù)合體，之后經(jīng)過E3級聯(lián)反應(yīng)將A3G泛素化再通過細胞內(nèi)蛋白酶體途徑將其降解。作為接頭蛋白，Vif用于募集E3復(fù)合物的功能位點已經(jīng)被研究的比較透徹，E3各組分與Vif相互作用位點包括：Vif氨基端與CBFβ結(jié)合、Vif羧基端的SOCS基序的SLQ保守位點與ElonginC結(jié)合、Vif SOCS基序下游保守的HCCH基序與Cullin5結(jié)合。其中Cullin5蛋白作為骨架蛋白、EB-EC作為調(diào)節(jié)亞基、CBFβ作為Vif蛋白折疊的輔因子共同形成具有活性的E3連接酶復(fù)合體。在人體中RBX蛋白主要以兩種亞型存在：RBX1和RBX2，作為Vif降解A3G的CRL復(fù)合體中與E2結(jié)合酶相互作用的Ring-蛋白的選擇性還有待明確。 本論文針對HIV-1Vif降解抗病毒因子A3G的CRL接酶復(fù)合體中對RBX的選擇性進行研究。首先通過免疫共沉淀，關(guān)鍵基序突變的方法探究了兩種亞型RBX與骨架蛋白Cullin5之間的相互作用；通過RNA沉默、關(guān)鍵基序突變的生物學(xué)手段分別在細胞體系和病毒體系評價了兩種RBX蛋白對于A3G降解機制的影響；此外又通過蛋白共折疊可溶性分析，多順反子載體上的蛋白共純化、體外構(gòu)建泛素化體系等多種生物學(xué)手段分析了不同RBX蛋白形成的E3復(fù)合體對A3G泛素化程度的影響。 在研究不同RBX與骨架蛋白Cullin5之間的相互作用方面，，我們發(fā)現(xiàn)不論是帶有標(biāo)簽或者不帶有標(biāo)簽的兩種RBX蛋白均能夠與Cullin5相互作用；反向的免疫共沉淀結(jié)果與上面結(jié)果一致，不論是帶有標(biāo)簽或者不帶有標(biāo)簽的Cullin5蛋白均與兩種RBX蛋白具有相互作用，并且兩種RBX蛋白與Cullin5的相互作用具有相互競爭抑制性。 在探究不同RBX蛋白對于A3G降解機制的結(jié)論中，我們發(fā)現(xiàn)不論在細胞體系還是病毒體系兩種RBX蛋白都能夠參與A3G的降解。并且相對比而言RBX2對于A3G的降解影響更明顯。 在含有不同RBX蛋白形成的E3復(fù)合體對A3G體外泛素化分析部分結(jié)果顯示兩種RBX蛋白形成的E3復(fù)合物均能在體外對A3G進行泛素化標(biāo)記。 因而我們得到結(jié)論：在人體中的兩種亞型的RBX蛋白均與CRL-Vif-CBFβ連接酶復(fù)合體中的骨架蛋白具有特異的相互作用，并且含有不同RBX的E3復(fù)合物均能夠在體外對A3G進行泛素化標(biāo)記，兩種RBX蛋白均對HIV-1Vif所介導(dǎo)的A3G降解具有一定的影響。 通過本論文對HIV-1Vif介導(dǎo)的A3G降解過程的E3復(fù)合物對Ring蛋白選擇性的研究結(jié)果延伸了我們對E3復(fù)合物功能機制的理解，為HIV的藥物治療提供了新的靶位點和可能性。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 RBX1/RBX2蛋白 Cullin-Ring泛素連接酶 Vif A3G
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-12
• 第1章 前言12-24
• 1.1 HIV-1 與限制因子 A3G 研究概述12-22
• 1.1.1 HIV-1 簡介12
• 1.1.2 限制因子及病毒輔助蛋白12-14
• 1.1.3 輔助蛋白 Vif 的功能研究14-15
• 1.1.4 抗病毒因子 A3G 的研究15-16
• 1.1.5 Vif 降解 A3G 的機制研究16-17
• 1.1.6 RING E3 連接酶的研究17-20
• 1.1.7 Cullin-RING 連接酶（CRLs）的研究20-22
• 1.2 本課題的研究目的與實驗設(shè)計22-24
• 1.2.1 研究目的22-23
• 1.2.2 實驗設(shè)計23-24
• 第2章 材料與方法24-36
• 2.1 材料、試劑及儀器24-29
• 2.1.1 質(zhì)粒、菌種、細胞、抗體24-26
• 2.1.2 主要試劑配制26-28
• 2.1.3 主要儀器與設(shè)備28-29
• 2.2 實驗方法29-36
• 2.2.1 真核體系質(zhì)粒構(gòu)建29-30
• 2.2.2 原核體系質(zhì)粒構(gòu)建30-32
• 2.2.3 蛋白表達32
• 2.2.4 Ni 柱親和純化32
• 2.2.5 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染32-33
• 2.2.6 RNA 干擾方法-siRNA33
• 2.2.7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 shRBX2 細胞系的建立33-34
• 2.2.8 Western Blot 檢測方法34
• 2.2.9 免疫共沉淀分析技術(shù)34-35
• 2.2.10 Nedd8 結(jié)合分析35
• 2.2.11 體外泛素化檢測35-36
• 第3章 結(jié)果與分析36-66
• 3.1 CRL 的骨架蛋白 Cul5 與 RBX 蛋白的相互作用36-43
• 3.1.1 質(zhì)粒 VR1012-Cul5、VR1012-RBX1、VR1012-RBX2 構(gòu)建表達36-38
• 3.1.2 Cullin5 與 RBX 蛋白的相互作用分析38-43
• 3.2 不同 RBX 組成的 E3 復(fù)合物對 A3G 降解機制的影響43-52
• 3.2.1 細胞體系內(nèi)對降解機制的影響43-50
• 3.2.2 病毒體系內(nèi)對降解機制的影響50-52
• 3.3 含有不同 RBX 的 E3 復(fù)合體泛素化 A3G 的討論52-66
• 3.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建52-57
• 3.3.2 含有不同 RBX 的 E3 復(fù)合物的蛋白表達與純化57-62
• 3.3.3 不同 E3 復(fù)合物對 Cul5 Nedd8 結(jié)合的分析62-64
• 3.3.4 不同 E3 復(fù)合物對 A3G 泛素化比較64-66
• 討論66-68
• 結(jié)論68-69
• 參考文獻69-76
• 致謝76-77
• 作者簡介77

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王瑞紅;史國利;程浩;范煒;路浩;;新型功能蛋白BST2研究進展[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2014年02期

2 尹鑫;魏萍;王曉鈞;;天然免疫限制因子Tetherin的抗病毒機理研究進展[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2014年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 高國振;宿主因子Cyclin T1和Sam68在Ⅰ型人免疫缺陷型病毒生活周期中的功能研究[D];武漢大學(xué);2012年

2 龐曉靜;BRET方法研究BST-2和HIV-1 Vpu相互作用及小分子化合物抑制劑的篩選[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 吳星亮;干擾素應(yīng)答分子Tetherin對抗馬傳染性貧血病毒的作用機制研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

2 朱迎紫;鈣離子及水解酶在HIV-1 Vpu對宿主限制因子Tetherin拮抗過程中的作用研究[D];吉林大學(xué);2014年

本文編號：880812