發(fā)布時間：2017-09-19 09:05

  本文關(guān)鍵詞：江西地區(qū)兒童感染的乙型肝炎病毒全基因組序列分析

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【摘要】：研究背景： 隨著國家大力推行新生兒接種乙肝疫苗的策略，我國乙型肝炎的流行得到了有效的控制，尤其是對兒童的預(yù)防起到了至關(guān)重要的作用。但仍有部分免疫兒童感染HBV，而兒童感染HBV易發(fā)展成為持續(xù)性和慢性非活動性感染，甚至肝細(xì)胞癌，成為潛在傳染源。免疫兒童感染HBV的機制較復(fù)雜，所感染的HBV基因組變異是其中主要原因之一。目前對兒童感染的HBV基因組的分子特征研究較少，江西地區(qū)乙肝疫苗免疫兒童感染的HBV基因組的分子特征及變異分析未見報道。 研究目的： 本研究擬從江西地區(qū)采集兒童感染的血清樣本，擴增HBV全基因組DNA并測序，對HBV基因組各開放讀碼框的變異進(jìn)行初步分析，以闡述免疫兒童感染HBV的病原分子特征，為預(yù)防和治療兒童感染HBV提供病毒學(xué)分子信息。 研究方法： 1.標(biāo)本的采集及初篩：留取2012年1月到2012年12月在江西省兒童醫(yī)院門診、住院及體檢的乙肝疫苗全程免疫患兒血清，酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）檢測HBV-M，篩選出HBV感染的陽性血清標(biāo)本。 2.全基因組DNA擴增和測序：采用三對重疊引物對HBV全基因組DNA進(jìn)行高保真PCR擴增并測序。 3. HBV基因及氨基酸序列的比對:利用Clustal X和Bioedit軟件將所獲得HBV全基因組的4個編碼區(qū)的核苷酸和氨基酸序列與參考序列進(jìn)行比對，分析主要及有意義的變異位點。 4.構(gòu)建HBV基因系統(tǒng)進(jìn)化樹并判定基因型：利用DNAstar、Clustal X和Mega4軟件對不同基因型以及標(biāo)本的S基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，以兒童標(biāo)本與已知基因型序列在進(jìn)化樹中所處的遺傳進(jìn)化關(guān)系作為分型依據(jù)，判定兒童感染的HBV的基因型。 5.基因亞型和血清型的確定：利用Clustal X軟件和Bioedit軟件對B基因型各亞型及標(biāo)本S基因的核苷酸序列做同源性比較以確定HBV的亞型。同時依據(jù)S基因S區(qū)第122位和160位的賴氨酸（K）/精氨酸（R）判斷d/y，w/r的亞型標(biāo)準(zhǔn)，判定所測標(biāo)本的血清型。 研究結(jié)果： 1.標(biāo)本收集:共收集乙肝疫苗全程免疫兒童（7.83±3.51歲）血清標(biāo)本11445份，男童6282人（54.89%），女童5163人（45.11%）。獲得HBV-M陽性血清標(biāo)本117份。 2.全基因組序列測序與分析：對HBsAg陽性標(biāo)本進(jìn)行分段重疊擴增并測序，最終拼接出58份完整的HBV基因組。對各開放讀碼框分別進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)S-ORF，C-ORF，P-ORF和X-ORF的氨基酸突變率分別為5.50%（22/400），2.36%（5/212），3.91%（33/843）和12.99%（20/154）。各ORF突變情況如下：①S-ORF中Pre-S1區(qū)N端主要的突變點及其突變率為：G2938C→D31H（5/58,8.62%）、A2990C→H48P（11/58,18.97%）、A2999C→N51T（12/58,20.69%）、C3041T→P65L（10/58,17.24%）、C3050T／C3051T→T68I（6/58,10.34%）、G3065T→G73V（5/58,8.62%）、C3097A→L84I（20/58,34.48%）、G3109A→V88M（6/58,10.34%）和A3136G→T97A（11/58,18.97%）。S區(qū)突變區(qū)域集中在120aa-200aa，主要的突變點及其突變率為： C533A→P127T （5/58,8.62%）、 A541C→Q129H（3/58,5.17%）、G588C→G145A（3/58,5.17%）、T753A→F200Y（18/58,31.03%）。②C-ORF中前C區(qū)主要突變點及其突變率為： A1814C／T1815C→M1P（8/58,13.79%）、G1896A→W28*（1/58,1.72%）。C區(qū)出現(xiàn)一例C1913A→P5T（1/58,1.72%）變異；③P-ORF出現(xiàn)散在分布的突變位點，未發(fā)現(xiàn)與耐藥性有關(guān)的突變位點，其RT區(qū)YMDD核序也未發(fā)生變異。④X-ORF氨基端主要突變點及其突變率為： G1437T/A→G22C/S （14/58,24.14%）、 G1476A→G35R（12/58,20.69%）和G1503A/T/C／T1504G→V44I/F/L/C（31/58,53.45%）。羧基端突變集中在120aa-150aa，主要的突變點及其突變率為： G1752A／T1753C→V127I/T （14/58,24.14%）、 A1762T→K130M （5/58,8.62%）、G1764A→V131I（5/58,8.62%）、T1800C→C143R（29/58,50%）、C1807G→P145R（29/58,50%）、G1809T／C1810G／A1811T→A146C/G（29/58,50%）、T1815C／G1816A／C1817T→C148R/H （29/58,50%）、 A1819G／C1820A→D149G（19/58,32.76%）。 3.基因型和血清型分析：本研究中獲得的58份兒童HBV基因序列均為B基因型。進(jìn)一步和B基因型各亞型做核苷酸同源性比對，結(jié)果與B2亞型的同源性最高，在99.0%~99.6%之間，標(biāo)本屬于B2亞型。根據(jù)S基因S區(qū)第122位和160位的氨基酸判定58份標(biāo)本血清型為adw型。 研究結(jié)論： 1.本研究成功獲得了江西地區(qū)兒童感染的HBV全基因組序列，，初步分析了兒童感染的HBV基因組的突變與分子特征。 2. S基因中的某些突變位點可能改變病毒的某些生物學(xué)性質(zhì)，如感染性、抗原性和免疫原性，是HBV免疫逃逸和持續(xù)感染的分子機制之一。 3.C基因某些位點突變可能改變了HBeAg和HBcAg在宿主內(nèi)的表達(dá)加工及分泌特征，同時也可能對宿主抗HBcAg的細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生了下調(diào)作用，是導(dǎo)致兒童HBV慢性感染的分子與免疫調(diào)節(jié)機制之一。 4. X基因氨基酸突變率較高，多個突變位點的HBx影響HBV的復(fù)制及表達(dá)的反式調(diào)節(jié)，在兒童HBV慢性感染起一定的作用。 5.江西地區(qū)兒童HBV以B基因型為主，且以B2亞型占主導(dǎo)。血清型以adw型為主。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 全基因組 兒童 突變 基因型 測序
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R373.21
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 縮略詞表12-14
• 第1章 引言14-21
• 1.1 乙型肝炎的一般情況14
• 1.2 HBV 基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白14-17
• 1.3 HBV 各 ORF 的熱點突變及意義17-20
• 1.4 本論文的研究內(nèi)容20-21
• 第2章 材料與方法21-27
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 研究對象21
• 2.1.2 血清標(biāo)本采集處理21
• 2.1.3 主要實驗儀器21-22
• 2.1.4 主要試劑22
• 2.1.5 HBV 基因序列的來源22
• 2.1.6 應(yīng)用軟件22
• 2.2 實驗方法22-26
• 2.2.1 血清免疫學(xué)指標(biāo) HBV-M 的檢測22-23
• 2.2.2 血清 HBV DNA 提取23-24
• 2.2.3 引物的設(shè)計與合成24
• 2.2.4 PCR 反應(yīng)體系和參數(shù)24-25
• 2.2.5 PCR 結(jié)果判定25
• 2.2.6 目的基因測序與拼接25
• 2.2.7 HBV 基因及氨基酸序列的比對25
• 2.2.8 構(gòu)建 HBV 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹并判定基因型、血清型25-26
• 2.3 質(zhì)量控制26-27
• 第3章 結(jié)果27-43
• 3.1 研究對象一般特征27
• 3.2 HBV 全基因擴增結(jié)果27-28
• 3.3 測序結(jié)果及序列分析28-35
• 3.3.1 HBV 全基因測序圖結(jié)果28
• 3.3.2 HBV 全基因組的核苷酸與氨基酸序列突變分析28-35
• 3.4 HBV 基因組突變率比較35-40
• 3.5 HBV 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及基因型血清型的判定40-43
• 第4章 討論43-47
• 第5章 結(jié)論與展望47-48
• 5.1 結(jié)論47
• 5.2 下一步工作進(jìn)展47-48
• 致謝48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 附圖55-64
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果64-65
• 綜述65-72
• 參考文獻(xiàn)70-72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：880725