本文關(guān)鍵詞：枯草桿菌蛋白酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及體外溶栓性質(zhì)

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【摘要】：隨著我國人口老齡化現(xiàn)象的日益嚴重，老年常發(fā)疾病血栓栓塞性疾病的發(fā)生也極為普遍，這種疾病也是當(dāng)前致死率很高的病因之一，治療這類疾病的主要手段則是溶栓療法，而纖溶酶主要是催化血栓中的主要成分纖維蛋白水解，從而達到溶解血栓的目的，纖溶酶可來源于動物、植物、微生物，而微生物則是纖溶酶的主要來源，枯草芽孢桿菌是人類最早發(fā)現(xiàn)的細菌，由于它的生長環(huán)境多樣，自身沒有致病性，對高溫、高熱、電磁輻射、紫外線等具有很強抗逆性，它可利用的營養(yǎng)物質(zhì)多種多樣，且能直接將許多蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，產(chǎn)生各種各樣的酶，一直是生物界研究熱點。 本文采用單因素實驗對實驗室保存菌種枯草桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，對發(fā)酵液產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶進行分離純化，測定了枯草桿菌蛋白酶中具有纖溶活性蛋白酶的部分酶學(xué)性質(zhì)，并研究其體外溶栓特點，為后續(xù)工作的展開奠定了基礎(chǔ)。 1、為提高枯草桿菌蛋白酶的產(chǎn)量，采用單因素實驗設(shè)計，通過搖瓶培養(yǎng)對枯草桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，優(yōu)化后培養(yǎng)基（w/v）為：麥芽糖1%、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O0.05%、CaCl20.02%、KH2PO40.4%；最適發(fā)酵條件為：初始pH7、溫度37℃、接種量為1%，最佳培養(yǎng)時間為48h。 2、將枯草桿菌按最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)48h后，將發(fā)酵液進行4℃、4000rpm離心20min，然后將發(fā)酵上清液加入60%飽和度的硫酸銨進行鹽析、透析后冷凍干燥得到粗酶粉，然后利用CM-sepharose Fast Flow對枯草桿菌蛋白酶進行分離純化，純化后得到純酶進行SDS-PAGE驗證，最后得到的酶分子量顯示低于14.3KDa，且具有纖溶酶活性，前人文獻中未見報道，，是一種新的溶栓酶。 3、為明確枯草桿菌蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)，研究了溫度、pH、金屬離子對其穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，枯草桿菌蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為60-70℃、溫度穩(wěn)定性范圍為40℃以下、最適反應(yīng)pH為7，pH穩(wěn)定性范圍為6-8，未發(fā)現(xiàn)能增強該酶活性的金屬離子。 4、研究了枯草桿菌蛋白酶體外溶栓的特點，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌蛋白酶在體外具有良好的溶栓能力，且溶栓過程紅細胞形態(tài)完整，對紅細胞無損害，對酶濃度具有梯度依賴性，其分解纖維蛋白能力強，具有直接分解纖維蛋白的能力。 本文分離純化的枯草桿菌蛋白酶具有纖溶和體外溶栓能力，具有重要意義，其具體性質(zhì)及體內(nèi)溶栓的能力及特點將是下一步實驗須進行的內(nèi)容，為臨床溶栓醫(yī)藥的研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：枯草桿菌蛋白酶 分離純化 酶學(xué)性質(zhì) 體外溶栓
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 0 前言12-26
• 0.1 枯草桿菌及其應(yīng)用12-15
• 0.1.1 枯草桿菌概述12
• 0.1.2 枯草桿菌的應(yīng)用12-15
• 0.2 血栓疾病及其危害15
• 0.3 血栓形成及溶解機理15-18
• 0.3.1 凝血系統(tǒng)16
• 0.3.2 抗凝血系統(tǒng)16-17
• 0.3.3 纖溶系統(tǒng)及其抑制物17-18
• 0.4 溶栓藥物研究現(xiàn)狀18-22
• 0.4.1 抗血小板藥物18
• 0.4.2 抗凝藥物18-19
• 0.4.3 溶栓藥物19-22
• 0.5 微生物來源溶栓酶研究進展22
• 0.6 纖溶酶酶活測定方法22-24
• 0.7 立題依據(jù)及研究意義24
• 0.8 研究意義24-26
• 1 枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵條件的優(yōu)化及發(fā)酵曲線的制備26-35
• 1.1 實驗材料、試劑與儀器26-27
• 1.1.1 菌株26
• 1.1.2 培養(yǎng)基26
• 1.1.3 主要試劑26
• 1.1.4 主要儀器26-27
• 1.2 實驗方法27-29
• 1.2.1 枯草桿菌蛋白酶活力測定27-28
• 1.2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化28-29
• 1.2.3 菌株培養(yǎng)及生長曲線的繪制29
• 1.3 實驗結(jié)果29-33
• 1.3.1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果29-32
• 1.3.2 枯草桿菌發(fā)酵曲線的繪制32-33
• 1.4 討論33
• 1.5 本章小結(jié)33-35
• 2 枯草桿菌蛋白酶粗酶提取及分離純化35-43
• 2.1 引言35
• 2.2 實驗材料、試劑與儀器35-36
• 2.2.1 試劑35
• 2.2.2 主要儀器35-36
• 2.3 實驗方法36-40
• 2.3.1 枯草桿菌蛋白酶粗酶的提取36
• 2.3.2 枯草桿菌蛋白酶的純化36-40
• 2.4 實驗結(jié)果40-41
• 2.4.1 枯草桿菌蛋白酶粗酶提取40
• 2.4.2 枯草桿菌蛋白酶純化實驗結(jié)果40-41
• 2.5 討論41-43
• 3 枯草桿菌蛋白酶的性質(zhì)研究43-51
• 3.1 材料、儀器、試劑43-44
• 3.1.1 材料43
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備43
• 3.1.3 主要試劑43-44
• 3.2 方法44-46
• 3.2.1 酶學(xué)性質(zhì)44-45
• 3.2.2 枯草芽孢桿菌蛋白酶的體外溶栓實驗45-46
• 3.3 實驗結(jié)果46-50
• 3.3.1 枯草桿菌蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)46-48
• 3.3.2 枯草桿菌蛋白酶溶解血栓活力測定48-50
• 3.6 本章小結(jié)50-51
• 4 全文總結(jié)51-53
• 論文的創(chuàng)新點53
• 論文的不足之處53-54
• 參考文獻54-59
• 英文縮略語59-60
• 致謝60-61
• 個人簡歷61
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文61-62

【參考文獻】

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本文編號：879500