本文關(guān)鍵詞：缺氧通過AMPK調(diào)控肌原細(xì)胞分化機(jī)理的初步研究和肌原細(xì)胞中IGF2調(diào)控PGC-1α機(jī)理的初步研究

  更多相關(guān)文章： 胰島素樣生長(zhǎng)因子2 PGC-1α AMPK 缺氧 分化

【摘要】：(1)缺氧是整個(gè)機(jī)體或局部機(jī)體失去了足夠氧氣供應(yīng)的一種情況，當(dāng)組織細(xì)胞得不到充足的氧氣，或不能充分利用氧氣時(shí)，如貧血、肺換氣不足和肺部纖維瘤，組織的代謝機(jī)能，甚至形態(tài)結(jié)構(gòu)都可能發(fā)生異常變化，特別是影響機(jī)體的氧化供能。生物有機(jī)體為了應(yīng)對(duì)缺氧脅迫，形成了一系列的缺氧應(yīng)答機(jī)制，最終使細(xì)胞、組織乃至整個(gè)生物體都能夠在氧氣濃度不足的情況下滿足能量代謝、生物合成等需要。 骨骼肌祖細(xì)胞能夠?qū)θ毖踝龀鰬?yīng)答。發(fā)育及運(yùn)動(dòng)中的骨骼肌往往處于缺氧環(huán)境中，而許多骨骼肌相關(guān)的疾病也表現(xiàn)出缺氧特征。缺氧能夠抑制肌原細(xì)胞的分化，這提示在發(fā)育中缺氧的微環(huán)境中或骨骼肌重塑的過程中，氧氣依賴的信號(hào)通路能夠抑制祖細(xì)胞的分化，直至有足夠的氧氣供應(yīng)，但其確切機(jī)制并不完全清楚。研究證實(shí)缺氧能夠通過激活缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1抑制Akt的活性，最終導(dǎo)致了肌原細(xì)胞分化能力減弱，而AMPK作為機(jī)體氧化壓力的感受器，，能被缺氧所激活，激活的AMPK通過抑制mTOR信號(hào)通路參與了缺氧應(yīng)答，這提示我們，AMPK也可能參與了骨骼肌的缺氧應(yīng)答。本研究旨在探明缺氧條件下AMPK信號(hào)通路以及Akt信號(hào)通路參與C2C12肌原細(xì)胞分化的機(jī)理，探明骨骼肌缺氧應(yīng)答的作用機(jī)制。 研究結(jié)果顯示，缺氧能抑制C2C12肌原細(xì)胞分化為多核的肌管細(xì)胞；同時(shí)在缺氧條件下的分化過程中，AMPK蛋白被激活，AMPK的抑制劑CompoundC能夠營(yíng)救缺氧抑制的細(xì)胞分化，因此缺氧抑制肌原細(xì)胞分化依賴AMPK。通常AMPK激活會(huì)抑制其下游mTOR的活性，而mTOR已經(jīng)被證實(shí)參與了肌細(xì)胞的分化，因此我們檢測(cè)了mTOR的兩個(gè)靶蛋白S6K1和4E-BP1的活性，發(fā)現(xiàn)缺氧以及AMPK活性改變沒有引起肌細(xì)胞mTOR通路變化。之前的研究證實(shí)缺氧通過激活HIF抑制了Akt活性，從而抑制了肌原細(xì)胞的分化，是否AMPK激活與Akt活性相互關(guān)聯(lián)？結(jié)果表明，抑制AMPK活性導(dǎo)致缺氧條件下Akt的磷酸化。哺乳動(dòng)物AMPKα有兩個(gè)亞型α1、α2，我們分別構(gòu)建了siRNA干擾AMPKα1、AMPKα2載體，結(jié)果顯示，分別敲降A(chǔ)MPKα1、AMPKα2均導(dǎo)致缺氧條件下Akt的磷酸化，說明AMPKα1、AMPKα2均抑制了Akt活性。以上結(jié)果表明缺氧導(dǎo)致了AMPK激活，而激活的AMPK抑制C2C12細(xì)胞的Akt的磷酸化。為了進(jìn)一步明確AMPK是如何抑制Akt活性的，我們檢測(cè)了Akt上游的接頭蛋白IRS1的活性，發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，IRS1Ser~(789)的磷酸化上調(diào)，而AMPK的抑制劑可以下調(diào)其磷酸化。研究已經(jīng)證實(shí)IRS1的Ser~(789)磷酸化后，IRS1活性降低，因此，推測(cè)缺氧條件下激活的AMPK能夠通過磷酸化IRS1Ser~(789)抑制其活性，從而抑制了其下游的PI3K/Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致分化受抑制。 本研究明確了能量感受器AMPK參與肌原細(xì)胞的分化，初步證實(shí)AMPK通過抑制Akt活性抑制細(xì)胞分化。這一結(jié)果豐富了我們目前對(duì)缺氧導(dǎo)致肌原細(xì)胞分化抑制的認(rèn)識(shí)，從分子水平上為治療肌肉損傷再生性等疾病提供了理論依據(jù)。 (2)胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-likegrowthfactors;IGFs)在生長(zhǎng)發(fā)育中的骨骼肌以及成人骨骼肌的重塑過程中都起著重要的作用。IGF2是一種胚胎肌肉發(fā)生的調(diào)節(jié)因子，并且是肌原細(xì)胞體外分化的自分泌起始因子。IGF2對(duì)骨骼肌的發(fā)育至關(guān)作用，而且在成人骨骼肌的再生和肥大等生理病理過程中也扮演著重要的角色。PGC-1α是機(jī)體能量代謝重要的感受器和調(diào)節(jié)器，因而它在能量代謝高的器官和組織含量豐富，以維持機(jī)體對(duì)能量的需求。PGC-1α不僅對(duì)骨骼肌的能量代謝有十分重要的作用，也與肌肉相關(guān)的疾病有關(guān)。但骨骼肌中PGC-1α的調(diào)控機(jī)制還不完全清楚。本研究旨在探明IGF2通過PGC-1α調(diào)節(jié)肌肉的能量代謝來調(diào)節(jié)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)生等過程，有利于進(jìn)一步為治療肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)和肌肉代謝疾病提供一定的理論依據(jù)和指導(dǎo)意義。 基于以上研究目的，我們進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在小鼠C2C12肌原細(xì)胞中，外源性的IGF2能夠下調(diào)PGC-1α的mRNA表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性。PI3K/Akt的抑制劑LY294002能夠營(yíng)救被IGF2下調(diào)的PGC-1αmRNA的表達(dá)。為進(jìn)一步研究PI3K/Akt調(diào)節(jié)PGC-1α的機(jī)制，我們構(gòu)建了FoxO1磷酸化位點(diǎn)突變的突變體FoxO1-3A。FoxO1是PGC-1α的轉(zhuǎn)錄因子，并且能夠被Akt在三個(gè)位點(diǎn)磷酸化后出核，因而抑制了其轉(zhuǎn)錄因子的功能，導(dǎo)致其靶基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)。我們將FoxO1-3A突變體轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，IGF2不能夠下調(diào)過表達(dá)FoxO1-3A突變體的C2C12細(xì)胞的PGC-1α，這項(xiàng)結(jié)果表明了Akt能夠磷酸化PGC-1α的轉(zhuǎn)錄因子使其出核從而導(dǎo)致了PGC-1α轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)。這些結(jié)果表明IGF2可以抑制小鼠C2C12肌原細(xì)胞的PGC-1α，而且是通過PI3K/Akt-FoxO1途徑實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：胰島素樣生長(zhǎng)因子2 PGC-1α AMPK 缺氧 分化
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-13
• 1 引言13-32
• 1.1 IGF信號(hào)通路簡(jiǎn)介13-16
• 1.1.1 IGF配體13-14
• 1.1.2 IGF-I型受體14-15
• 1.1.3 IGF-II型受體15-16
• 1.2 肌發(fā)生16-19
• 1.2.1 肌肉與肌發(fā)生16-17
• 1.2.2 肌發(fā)生中的轉(zhuǎn)錄因子17-18
• 1.2.3 調(diào)控肌發(fā)生的信號(hào)通路18-19
• 1.3 缺氧與生物應(yīng)答19-20
• 1.3.1 缺氧19
• 1.3.2 生物體對(duì)缺氧的應(yīng)答機(jī)制19-20
• 1.4 AMP激活的蛋白激酶簡(jiǎn)介20-27
• 1.4.1 AMPK的結(jié)構(gòu)21-22
• 1.4.2 AMPK的調(diào)控22-23
• 1.4.3 AMPK與氧化壓力應(yīng)答23-25
• 1.4.4 AMPK與心血管疾病25-26
• 1.4.5 總結(jié)26-27
• 1.5 過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α簡(jiǎn)介27-28
• 1.5.1 PGC-1α的結(jié)構(gòu)和家族27-28
• 1.5.2 PGC-1α與代謝性疾病的關(guān)系28
• 1.6 小鼠C2C12成肌細(xì)胞——研究肌肉分化的模式細(xì)胞28-29
• 1.7 立題依據(jù)和研究意義29-32
• 2 缺氧通過AMPK調(diào)控肌原細(xì)胞分化機(jī)理的研究32-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法32-36
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料32
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法32-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-45
• 2.2.1 C2C12肌原細(xì)胞分化為多核的肌管細(xì)胞能被缺氧所抑制36-37
• 2.2.2 AMPK可以被缺氧激活37-38
• 2.2.3 AMPK的抑制劑CompoundC可以營(yíng)救被缺氧抑制的肌原細(xì)胞的分化38-40
• 2.2.4 缺氧條件下AMPK抑制劑CompoundC可以上調(diào)Akt的磷酸化水平40-41
• 2.2.5 缺氧條件下AMPK抑制劑CompoundC不影響mTORC1信號(hào)通路41-42
• 2.2.6 AMPKα1及α2干擾效率的檢測(cè)42
• 2.2.7 缺氧條件下shAMPKα1/2可以營(yíng)救下調(diào)的Akt的磷酸化42-43
• 2.2.8 缺氧條件下AMPK抑制劑CompoundC可以下調(diào)IRS1的磷酸化水平43-45
• 2.3 討論45-47
• 3 C2C12肌原細(xì)胞中IGF2下調(diào)PGC-1α機(jī)理的研究47-62
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法47-53
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法48-53
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-60
• 3.3.1 胰島素(insulin)抑制肌原細(xì)胞PGC-1αmRNA的表達(dá)水平53-54
• 3.3.2 IGF2抑制肌原細(xì)胞PGC-1αmRNA表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄活性54-55
• 3.3.3 IGF2抑制PGC-1αmRNA表達(dá)水平通過PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)55-56
• 3.3.4 IGF2不能夠下調(diào)FoxO1mRNA表達(dá)水平56-57
• 3.3.5 FoxO1-3A突變體的構(gòu)建57-58
• 3.3.6 Foxo1的磷酸化對(duì)IGF2抑制PGC-1αmRNA表達(dá)水平以及其轉(zhuǎn)錄活性都起著重要作用58-60
• 3.4 討論60-62
• 4 總結(jié)62-65
• 4.1 缺氧通過AMPK調(diào)控肌原細(xì)胞分化機(jī)理的研究62-63
• 4.2 C2C12肌原細(xì)胞中IGF2下調(diào)PGC-1α機(jī)理的研究63-65
• 5 展望65-68
• 5.1 缺氧通過AMPK調(diào)控肌原細(xì)胞分化機(jī)理的研究65
• 5.2 C2C12肌原細(xì)胞中IGF2下調(diào)PGC-1α機(jī)理的研究65-68
• 參考文獻(xiàn)68-76
• 致謝76-77
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷77
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文77-78

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本文編號(hào)：875795