本文關(guān)鍵詞：人胚胎干細(xì)胞向胰島素陽性細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系的優(yōu)化

  更多相關(guān)文章： 人胚胎干細(xì)胞 胰島素陽性細(xì)胞、誘導(dǎo)

【摘要】：第一章人胚胎干細(xì)胞(hESCs)向胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的比較 目的：通過比較文獻(xiàn)中已報道的效率較高的誘導(dǎo)方案,找到在本實驗室條件下獲得胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞的最佳誘導(dǎo)方案。 方法：體外誘導(dǎo)hESCs需要依次經(jīng)歷限定性內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)分泌前體最終才會成為胰島素陽性細(xì)胞,這是體內(nèi)β細(xì)胞發(fā)育分化過程的重演。利用本實驗室已經(jīng)建立好的條件,將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)至限定性內(nèi)胚層階段。然后分三組分別用D'Amour、Hongkui Deng、Hosoya實驗室報道的誘導(dǎo)方案將細(xì)胞往胰腺內(nèi)分泌前體誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)的第10天以及第13天收集樣本,用免疫熒光、間標(biāo)流式、real-time PCR等檢測手段比較三種誘導(dǎo)方案獲得胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞的效率。 結(jié)果：僅Hosoya小分子方案組在第10天至第13天的過程中PDX1十細(xì)胞的比例出現(xiàn)明顯的上調(diào)；D'Amour組呈現(xiàn)顯著下降趨勢；Hongkui Deng組呈現(xiàn)基本持平狀態(tài)。僅Hosoya小分子方案組在第10天至第13天能持續(xù)檢測到較多的NGN3+細(xì)胞；D'Amour組呈現(xiàn)下降趨勢,且NGN3+細(xì)胞比例很低；Hongkui Deng組幾乎檢測不到NGN3+細(xì)胞。 結(jié)論：僅Hosoya小分子方案能更好的將限定性內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞(PDX1+NGN3+). 第二章人胚胎千細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽性(Ins+)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究 目的：比較基礎(chǔ)培養(yǎng)基：D/F-12、高糖-DMEM;成熟因子方案與HOsoya的小分子方案獲得胰島素陽性細(xì)胞的效率。 方法：利用第一章所得到的優(yōu)勢方案(小分子誘導(dǎo)方案),將hESCs誘導(dǎo)至胰腺內(nèi)分泌前體起始階段,即誘導(dǎo)的第10天。然后將細(xì)胞分為兩大組,其中一組用成熟因子方案誘導(dǎo),另一組繼續(xù)用Hosoya實驗室報道的小分子方案誘導(dǎo)；分別考察兩種誘導(dǎo)方案下,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同葡萄糖濃度在誘導(dǎo)第18天獲得Ins+細(xì)胞的差異。用免疫熒光、間標(biāo)流式、real-time PCR等檢測手段比較各方案獲得Ins+細(xì)胞的效率。 結(jié)果：高糖-DMEM加成熟因子組在誘導(dǎo)的第18天獲得Ins+細(xì)胞的效率最高,達(dá)27.43%±2.97%。D/F-12加成熟因子組、高糖-DMEM加小分子組和D/F-12加小分子組的Ins+細(xì)胞比例都不及21%。而追溯到誘導(dǎo)的第13天檢測成熟因子和小分子組在表達(dá)胰腺內(nèi)分泌前體階段標(biāo)記基因顯示成熟因子組PDX1、NGN3、Beta2基因的mRNA的相對表達(dá)量是小分子組的數(shù)倍 結(jié)論：培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對終末形成Ins+細(xì)胞效率在成熟因子組中高糖能促使p細(xì)胞增殖,低糖能使細(xì)胞內(nèi)Ins含量增加；而在小分子組中無區(qū)別。在獲得Ins+細(xì)胞效率上高糖-DMEM加成熟因子比小分子方案有優(yōu)勢,其原因可能并不是胰腺內(nèi)分泌前體階段,PDX1+NGN3+細(xì)胞數(shù)量的多少,而與其PDX1和NGN3表達(dá)量有關(guān)。推測PDX1、NGN3的表達(dá)可能存在一個閾值是激活其下游基因啟動所必須的。 第三章人胚胎干細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽性細(xì)胞誘導(dǎo)方案的優(yōu)化 目的：以高糖-DMEM加成熟因子誘導(dǎo)方案為基礎(chǔ)優(yōu)化人胚胎干細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽性細(xì)胞誘導(dǎo)方案 方法：利用第一章所得到的優(yōu)勢方案(小分子誘導(dǎo)方案),將hESCs誘導(dǎo)至胰腺內(nèi)分泌前體起始階段,即誘導(dǎo)的第10天。以第二章中高糖-DMEM加成熟因子誘導(dǎo)方案為基礎(chǔ)進(jìn)行分組,將成熟因子Betacellulin、Exendin-4、IGF-1進(jìn)行自由組合,分為無因子組、單因子組、雙因子組、三因子組。將細(xì)胞誘導(dǎo)至第18天,用免疫熒光、間標(biāo)流式、real-time PCR等檢測手段比較各方案獲得Ins+細(xì)胞的效率。 結(jié)果：在誘導(dǎo)第18天獲得Ins+細(xì)胞比例最高的三組分別為雙因子組中的Exendin-4IGF-1、單因子組中的Exendin-4及IGF-1,其值分別為：32.63%±8.50%、31.60%±2.16%、30.63%±1.37%。其中單因子組中Exendin-4在real-time PCR檢測的各項胰島終末細(xì)胞標(biāo)記基因的mRNA相對表達(dá)量與其余組相比明顯要高。免疫熒光也直觀的反應(yīng)出其優(yōu)勢 結(jié)論：在高糖-DMEM加成熟因子誘導(dǎo)方案基礎(chǔ)上優(yōu)化后,高糖-DMEM加單因子Exendin-4在D18可獲得31.60%±2.16%Ins+細(xì)胞,是目前在我們實驗室條件下獲得的最高誘導(dǎo)效率。
【關(guān)鍵詞】：人胚胎干細(xì)胞 胰島素陽性細(xì)胞、誘導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 前言13-14
• 第一章 人胚胎干細(xì)胞(HESCS)向胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的比較14-26
• 1. 材料與試劑14-17
• 1.1 細(xì)胞14-15
• 1.2 試劑15-16
• 1.3 試劑-分子生物學(xué)16
• 1.4 主要儀器16-17
• 2. 方法17-20
• 2.1 人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)17
• 2.2 hESCs的誘導(dǎo)分化17
• 2.3 免疫熒光17-18
• 2.4 間標(biāo)流式檢測18-19
• 2.5 RNA的抽提和cDNA的合成19
• 2.6 real-time PCR檢測19-20
• 3 結(jié)果20-24
• 3.1 hESCs的誘導(dǎo)分化20-21
• 3.2 免疫熒光染色結(jié)果21-22
• 3.3 間標(biāo)流式檢測結(jié)果22-23
• 3.4 real-time PCR檢測基因表達(dá)結(jié)果23-24
• 4 討論24-26
• 第二章 人胚胎干細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽性細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究26-39
• 1. 材料與試劑27-29
• 1.1 細(xì)胞27
• 1.2 試劑27-29
• 1.3 主要儀器29
• 2. 方法29-33
• 2.1 人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)29-30
• 2.2 hESCs的誘導(dǎo)分化30
• 2.3 免疫熒光30
• 2.4 間標(biāo)流式檢測30-31
• 2.5 RNA的抽提和cDNA的合成31-32
• 2.6 real-time PCR檢測32
• 2.7 胰島素陽性細(xì)胞中平均胰島素含量測定32-33
• 3 結(jié)果33-38
• 3.1 hESCs的誘導(dǎo)分化33
• 3.2 免疫熒光染色結(jié)果33-34
• 3.3 間標(biāo)流式檢測結(jié)果34-37
• 3.4 real-time PCR檢測基因表達(dá)結(jié)果37-38
• 3.5 胰島素陽性細(xì)胞中平均胰島素含量測定38
• 4 討論38-39
• 第三章 人胚胎干細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽性細(xì)胞誘導(dǎo)方案的優(yōu)化39-52
• 1. 材料與試劑39-41
• 1.1 細(xì)胞39
• 1.2 試劑39-41
• 1.3 主要儀器41
• 2. 方法41-45
• 2.1 人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)41-42
• 2.2 hESCs的誘導(dǎo)分化42
• 2.3 間標(biāo)流式檢測42-43
• 2.4 RNA的抽提和cDNA的合成43-44
• 2.5 real-time PCR檢測44
• 2.6 免疫熒光44-45
• 3 結(jié)果45-50
• 3.1 hESCs的誘導(dǎo)分化45
• 3.2 間標(biāo)流式檢測結(jié)果45-47
• 3.3 real-time PCR檢測基因表達(dá)結(jié)果47
• 3.4 免疫熒光染色結(jié)果47-50
• 4 討論50-52
• 總結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 綜述55-67
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 致謝67-68
• 個人簡歷68

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Juan Domínguez-Bendala;Camillo Ricordi;;Present and future cell therapies for pancreatic beta cell replenishment[J];World Journal of Gastroenterology;2012年47期

2 劉國強;魏蕊;洪天配;;干細(xì)胞移植治療糖尿病的研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2014年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 申晶;骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞輸注促進(jìn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰腺內(nèi)α細(xì)胞向β細(xì)胞的轉(zhuǎn)變：糖尿病治療的新模式[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳桃;hUCMSCs分化為IPCs后免疫原性的變化[D];暨南大學(xué);2013年

2 吳海偉;體外誘導(dǎo)hUC-MSCs分化的微生物代謝物篩選及分離鑒定研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

3 余丹峰;體外胰島細(xì)胞共培養(yǎng)及化學(xué)因子聯(lián)合誘導(dǎo)NOD鼠iPSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

，

本文編號：871160