本文關(guān)鍵詞：云南西部HIV陽性者感染弓形蟲基因分型的初步研究

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【摘要】：弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)的寄生原蟲，可寄生在宿主除紅細(xì)胞外的所有有核細(xì)胞中，引起嚴(yán)重的人獸共患弓形蟲病。弓形蟲寄生宿主的種類非常廣泛，呈世界性分布趨勢，可以感染所有的溫血?jiǎng)游�，包括人類在�?nèi)。弓形蟲還是一種機(jī)會性致病寄生蟲，當(dāng)弓形蟲感染人體后，免疫功能正常者大多表現(xiàn)為無臨床癥狀的隱性感染；免疫功能低下或缺陷者，可出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，甚至死亡。弓形蟲感染妊娠期婦女后，可導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎、死胎等嚴(yán)重不良后果。弓形蟲還可經(jīng)過胎盤垂直傳播，引起新生兒的先天性弓形蟲病。繼發(fā)弓形蟲感染是AIDS患者最為常見的機(jī)會性感染疾病之一，引起AIDS患者嚴(yán)重的弓形蟲腦病而致死。而隨著HIV感染率逐年升高，弓形蟲感染引起來的相關(guān)疾病越來越受到世界關(guān)注。 根據(jù)其對小鼠的致病力強(qiáng)弱可將弓形蟲分為強(qiáng)毒株和弱毒株。通過對基因分析可將弓形蟲分為3個(gè)主要基因型,I型為強(qiáng)毒株，II型和III型為弱毒株。隨著對弓形蟲基因型的研究不斷進(jìn)展，越來越多的重組或非典型基因型被發(fā)現(xiàn)，已初步形成了將弓形蟲蟲株分為多個(gè)基因型的觀點(diǎn)。不同基因型弓形蟲株之間的毒力、感染力等存在較大差異，對藥物的敏感性也不同。通過對弓形蟲株進(jìn)行基因分型對弓形蟲病的防治及其流行病學(xué)特征研究有著非常重要的意義。本實(shí)驗(yàn)收集云南省部分地區(qū)HIV陽性者血液，利用血液樣本對云南省HIV陽性者感染弓形蟲基因型進(jìn)行研究，初步確定云南省HIV陽性者感染弓形蟲基因型，為云南省HIV陽性者弓形蟲病的防治提供重要參考。 1.研究目的： 了解云南西部HIV陽性者弓形蟲感染的基本情況，初步分析并確定云南西部HIV陽性者感染弓形蟲的主要基因型，從而為云南西部HIV陽性者弓形蟲病的防治及其流行病學(xué)研究提供重要參考和理論依據(jù)。 2.研究方法： 2.1樣本收集 收集云南西部大理白族自治州、保山市、德宏傣族景頗族自治州艾滋病防治機(jī)構(gòu)的HIV陽性者血液樣本，均經(jīng)蛋白印跡(WB)試驗(yàn)陽性確證。 2.2弓形蟲抗體檢測 將收集到的HIV陽性者血液樣本應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行弓形蟲IgG和IgM抗體檢測，篩選弓形蟲IgG和或IgM陽性出標(biāo)本。 2.3基因提取及擴(kuò)增、回收、純化 采用全血基因提取試劑盒對弓形蟲IgG和IgM陽性的血液樣品進(jìn)行基因提��；引用國際上成熟的引物及巢氏PCR技術(shù)對弓形蟲B1基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)兩輪擴(kuò)增后電泳，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析。對弓形蟲B1基因擴(kuò)增陽性的樣本，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化。 2.4酶切 用限制性內(nèi)切酶Pm1I和XhoI對弓形蟲B1基因擴(kuò)增陽性產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切后電泳結(jié)果與弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行對比、鑒定，確定基因型。 2.5測序 將弓形蟲B1基因擴(kuò)增陽性的產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化后，挑選7份（1份弓形蟲速殖子感染小鼠血、5份HIV陽性者血液樣本、1份純化弓形蟲速殖子、）送到上海立菲測序有限公司和大連寶生物有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與Genbank上注冊的弓形蟲株基因序列進(jìn)行對比分析。 3.結(jié)果： 3.1血清抗體檢測 本次檢測共355份全血樣本，其中弓形蟲IgG抗體陽性132份，陽性率為37%；弓形蟲IgM抗體陽性有10份，陽性率為2.8%；兩者合起來的總陽性率為40%。本次檢測共挑選出142份弓形蟲抗體陽性的HIV陽性者全血樣本。 3.2基因擴(kuò)增及酶切 本實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增出B1基因的血樣有33份，電泳成像后可見一大小約530bp的條帶。隨機(jī)挑選出12份標(biāo)本與1份弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)基因I型株（RH株）進(jìn)行酶切和對比，，酶切后電泳，13份標(biāo)本均可見一大小為530bp左右的條帶。借用國際實(shí)驗(yàn)結(jié)果：II型（Me49）和III（C56）型酶切時(shí)可見分別為400bp和130bp的兩個(gè)條帶，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比、分析。 3.3序列分析 將云南西部HIV陽性者感染弓形蟲株、標(biāo)準(zhǔn)株（RH）和Genbank注冊的弓形蟲株基因序列進(jìn)行對比分析，它們之間的堿基對差異主要有以下3處：在第11對堿基處Genbank注冊的弓形蟲株多出A；在第61對堿基處，Genbank注冊的弓形蟲株表現(xiàn)為A、G堿基對的缺失；在第230對堿基處，云南西部HIV陽性者感染弓形蟲第3株為A，而其它蟲株為G。 4.結(jié)論 4.1云南西部地區(qū)HIV陽性者弓形蟲感染率較高。 4.2云南西部HIV陽性者感染弓形蟲株酶切結(jié)果與國際標(biāo)準(zhǔn)基因I型株（RH株）一致，初步確定云南西部HIV陽性者感染的弓形蟲基因型主要為I型。 4.3各弓形蟲株B1基因之間的差異率非常小，但還是有部分弓形蟲株的堿基對存在缺失或突變。 4.4云南西部HIV陽性者感染的弓形蟲是否還存在其它基因型，還有待進(jìn)一步研究。 5.本實(shí)驗(yàn)研究的創(chuàng)新點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)通過收集云南西部地區(qū)艾滋病防治機(jī)構(gòu)的HIV陽性者血液樣本，利用ELISA進(jìn)行弓形蟲抗體檢測，選擇弓形蟲抗體陽性的血液樣本進(jìn)行基因提取、弓形蟲B1擴(kuò)增、酶切及序列分析，初步確定云南西部地區(qū)HIV陽性者感染弓形蟲的基因型。本實(shí)驗(yàn)主要的創(chuàng)新點(diǎn)： 直接從全血標(biāo)本中提取弓形蟲基因并成功擴(kuò)增出弓形蟲B1基因。
【關(guān)鍵詞】：HIV陽性 弓形蟲 巢氏PCR 限制性內(nèi)切酶 序列分析 基因分型
【學(xué)位授予單位】：大理學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R382.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-14
• 第一部分 云南西部 HIV 陽性者血液樣本弓形蟲 IgG 和 IgM 檢測14-19
• 材料與方法14-17
• 結(jié)果17-18
• 討論18-19
• 第二部分 云南西部 HIV 陽性者感染弓形蟲基因型分析19-38
• 材料與方法19-29
• 結(jié)果29-34
• 討論34-38
• 總論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-45
• 附錄（攻讀碩士期間發(fā)表的論文）45-46
• 綜述46-54
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 致謝54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：862114